1. 生物化学与化学生物学
  2. 神经科学
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τ单体编码菌株

  1. 阿普拉瓦·M·夏尔马
  2. 塔利莎·托马斯
  3. 达纳埃尔伍德
  4. 奥玛尔·M·克什默
  5. 马克一号钻石 是通讯作者
  1. 德克萨斯大学西南医学中心,美国
  2. 圣路易斯华盛顿大学美国
研究进展
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引用本文AS:188bet体育电竞ELIFE 2018;7:E37813 DOI:10.7554/188bet体育电竞elife.37813

摘要

陶蛋白病患者的表现形式多样,进展,以及神经病理学。它们与tau-prion毒株有关,独特的第四纪构造的自我复制组合,其来源不明。菌株可以在培养细胞中无限期繁殖,并在小鼠中诱发独特的遗传性神经病理学模式。DS9和DS10细胞系繁殖来自重组tau的不同合成菌株。我们先前观察到,τ单体采用两种构象状态:一种是惰性的(M)和一个种子能力强的(mS米尔巴哈等,二千零一十八)我们现在发现S它本身由多个编码独特菌株的稳定合奏组成。接种到原始细胞中的DS9单体只编码DS9,而DS10单体编码多个子菌株。各亚株在接种到τ蛋白病变小鼠模型(PS19)后均诱导了不同的病理学。米S从阿尔茨海默病中提纯的大脑编码了一个菌株。相反地,米S来自皮质基底部退化的大脑编码的三个子株,其中任何一种单体在接种到细胞后都重新建立了这三种单体。因此,种子活性τ单体采用多个,稳定的种子适应性构象,每一个都编码有限数量的菌株。这提供了对不同tauopathie的出现的洞察,可提高诊断和治疗水平。

网址:https://doi.org/10.75188bet体育电竞54/elife.37813.001

介绍

tau病变是一组不同的神经退行性疾病,其定义是tau淀粉样蛋白在神经元和胶质细胞中的积累。(李等人,二千零一)包括阿尔茨海默病(AD)和皮质基底部变性(CBD)。在许多临床和神经病理学综合征中。大多数是零星的,一些是由微管相关蛋白tau(MAPT)基因的显性突变引起的。(李等人,二千零一)对不同的偶发性陶蛋白病变的起源了解甚少。我们最初假设它们可能来自不同的自蔓延组件基于我们观察到单个τ单体在体外稳定地传播不同的结构,取决于最初暴露的模板(弗罗斯特等人,2009年A)我们组和其他组的实验随后表明,tau将淀粉样蛋白病理学传递到培养细胞和小鼠大脑中,这些细胞可以在细胞间移动。(弗罗斯特等人,2009年BClavaguera等人,二千零九)并导致了这样一个想法,那就是“像朊病毒一样”。

朊病毒蛋白(prp)朊病毒形成“菌株”,这是一种独特的淀粉样结构,来源于一种在活系统中无限繁殖的蛋白质。这是人类和小鼠神经病理学的多样性和可预测模式的基础。我们发现,tau在一个稳定的表达重复域(rd)的系中形成菌株,包含两个融合到黄色荧光蛋白(rd-yfp)的疾病相关突变(p301l/v337m),该重复域(rd)可被分离并从细胞繁殖到细胞。我们最初创造了两个“人工”菌株,基于将重组纤维接种到RD-YFP细胞,分离出两个稳定繁殖不同构象聚集物的克隆系:DS9和DS10。将DS9和DS10溶解物接种到基于1n4r人类tau表达和单一疾病相关突变(p301s)的tau病变(ps19)小鼠模型中。(Yoshiyama等人,二千零七)产生了不同的神经病理学表型。这些可以在多代小鼠中稳定传播,最后回到了rd-yfp生物传感器细胞,其中ds9和ds10菌株显示其原始形态(桑德斯等人,二千零一十四)此外,利用rd-yfp生物传感器细胞,我们从患有不同tau病变的患者的大脑中分离出不同的tau菌株群。与朊病毒蛋白(prp)不同,tau尚不清楚会导致人类感染性神经退行性疾病。然而,从重组蛋白中产生两类感染性蛋白颗粒,这两类蛋白颗粒在神经病理学中具有不同的和稳定的遗传模式。我们建议把陶视为朊病毒。(桑德斯等人,二千零一十四

随后,我们创造了18种不同的tau-prion菌株,观察到在小鼠脑内接种后,它们产生了不同的病理模式和进展率。(考夫曼等人,二千零一十六)的确,其他研究者在接种人类tau病变的tau纤维制剂后,对神经病理多样性进行了类似的观察。(Clavaguera等人,二千零一十三)我们得出的结论是,除了环境和遗传因素的可能作用外,tauopathy的多样性在很大程度上可以通过其下面的菌株来解释,换言之,蛋白质构象(考夫曼等人,二千零一十六

在确定最小传染单位的工作中,或者是陶朊病毒的“种子”,我们先前确定τ单体采用多个,我们将稳定结构分为两类:“惰性”(m))或“种子能力”(mS米尔巴哈等,二千零一十八)虽然M不会自发地自组装或种子聚集,米S有一个独特的结构,允许自我组装和播种活动。我们已经分离出S来源于重组来源和人脑。通过尺寸排除色谱(SEC)分离并通过100kd截止过滤器后,它保持其活性(米尔巴哈等,二千零一十八)结构研究(米尔巴哈等,二千零一十八)建议MS有别于M基于关键氨基酸的暴露(二百七十五维奇克二百八十/三百零六维奇维克三百一十一)以前被确定介导淀粉样蛋白形成的(von Bergen等人,二千von Bergen等人,二千零一)m它们被预测埋在发夹中,分子间的相互作用相对难以接近。

M的存在S作为一个独特的构象集合,单体在应变形成中的作用提出了一个问题。我们考虑了两种可能性。第一,M的单一结构S可能是多个不同程序集的基础。这被认为是从AD患者身上分离出的两种不同的纤维形态的基础。在这两种结构中,相同的基本单体构建基块似乎构成淀粉样蛋白的“核心”。(Fitzpatrick等人,二千零一十七)第二,安S蛋白质可以采用多种不同的构象作为一个整体,在一个多聚体组合中,每一个产生一个单独的菌株或菌株的子集。这将预测我们先前描述的tau-prion菌株的多样性。(桑德斯等人,二千零一十四考夫曼等人,二千零一十六)可与一组不同的τ单体异构体连接。我们通过研究在HEK293T细胞中繁殖的菌株来解决这个问题。DS9和DS10,是从重组纤维中提取的,其他来源于广告和CBD大脑。

结果

τ单体决定菌株的特性

我们之前详细描述了两个tau菌株,DS9和DS10~(?)桑德斯等人,二千零一十四)我们假设如果mS充当“无限制”构建基块,从DS9或DS10中提取的单体将产生多种菌株。我们使用尺寸排除色谱法(sec)或通过100kd尺寸排除过滤器从DS9中分离出总溶解物或单体。我们以前确定要忠实地排除较大程序集的方法(米尔巴哈等,二千零一十八)然后我们给DS1细胞接种,缺乏聚集物,并用FAC分离出单个含集料的单元,在此基础上建立了单株系,以供进一步分析。我们最初使用表观荧光显微镜来表征包合形态的不同菌落。作为菌株识别的粗略替代物(桑德斯等人,二千零一十四考夫曼等人,二千零一十六)对于MS源自DS9,我们没有观察到任何变化,52个克隆中的每一个都表现出先前观察到的DS9的斑点状构象。(桑德斯等人,二千零一十四图1A)我们分离出6个典型的“亚菌株”,称为DS9.1–9.6,以进一步详细描述。此外,我们将裂解液通过100kd大小的排除过滤器,并用它接种DS1细胞,创建31个单克隆系。用共聚焦显微镜观察,均与DS9无明显差异。使用未分离的DS9裂解液接种,或任一子株的裂解产物产生单一的克隆群,形态均与DS9相同(图1A

τmS来自DS9的保持了应变特性。

)从DS9单体(9.1–9.6)分离出的克隆表现出与DS9相似的形态特征。()有限的蛋白水解会消化DS1中的所有单体,但显示DS9和DS9.1–9.6具有相似的蛋白酶抗性带型。DS9及其亚株均表现出约10 kD的条带。第二个波段在20到25 kd之间。(C)对DS1进行了沉降分析。9,及其子暴雨DS9.1–9.6。通过超速离心将总溶解物分解为上清液和颗粒物。在凝胶上负载的上清液对凝胶样品的比例为1∶1。DS1上清液中有tau,而DS9及其基质主要位于颗粒中。波段代表在~45kd处的rd-yfp。(D)DS9和亚株转化到p301s FRET生物传感器细胞后具有相似的种子活性。图像代表着数千个类似的细胞。蛋白质印迹至少代表三个复制品。播种试验代表一个单独的实验,每个数据点代表一个样本,分三份进行分析。误差线代表标准偏差。

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我们以前用不溶性tau的蛋白水解来鉴别不同的菌株。这揭示了tau聚合体的抗蛋白酶“核心”的变化。(桑德斯等人,二千零一十四考夫曼等人,二千零一十六)DS1没有蛋白酶抗性。DS9和DS9.1–9.6表现出非常相似的有限蛋白水解模式,带10 kd的带子,20至25 kd(图1B)接下来,我们使用沉降分析来区分克隆,通过高速离心使澄清的溶解液分离可溶性和不溶性物质。DS9和DS9.1–9.6表现出相似的分馏模式,大部分tau不溶(图1C)最后,我们用一种表达tau-rd(p301s)的已建立的生物传感器细胞系(p301s)融合到青色和黄色荧光蛋白(rd-cfp/yfp)来监测菌株触发细胞内聚集的能力。DS9和DS9.1–9.6的最大播种量相同,剂量反应在~1对数浓度范围内变化,这对于同一菌株的独立分离株来说是典型的。(图1D)因此,来自DS9的单体忠实编码六个相同的DS9亚株。

DS10单体编码多个子菌株

扩展我们对DS9的研究,我们分离出总溶解物或M。S从DS10,转导的ds1细胞,分离出多条单克隆包裹体承载线。正如我们之前报道的那样,用未分离的DS10裂解液接种产生了单个克隆群,全部与DS10相同(桑德斯等人,二千零一十四)然而,DS10单体产生了五个不同的亚菌株,包涵体形态易于识别:36%被定级(与母体菌株不可区分),称为DS10.1;21%的人有斑点,被称为DS102;13%是线状的,被称为DS103;9%的人没有组织,被称为DS104(图2A表1)约21%的细胞形成第五个菌株,DS105迅速的“部门化”,即,失去了内含物,因此无法进一步描述。所有的应变图像都由一位盲评者(D.R.W.)进行分析。DS10单体也用100kD截止过滤器分离。在转化成ds1细胞后,我们分离出单克隆株。得到了相似的应变多样性(表2

τmS从DS10创建多个子菌株。

)从DS10单体分离出的克隆产生具有多种形态的细胞。通过多次试验对4个亚株进行了鉴定。()利用蛋白酶原酶对RD-YFP进行有限的蛋白水解,分离出该菌株中的蛋白酶抗性核心。车道1代表DS1,由完全消化的RD-YFP单体组成。(C)在DS1上进行了RD-YFP的沉降分析。10,DS101—4。通过超速离心将总溶解物分解为上清液和颗粒物。在凝胶上负载的上清液对颗粒的比例为1∶1。DS1上清液中含有rd-yfp;DS10,10.1和10.2颗粒中的Rd-yfp含量最高;DS10.3和DS10.4具有混合的RD-YFP溶解性。(D)DS10菌株转化到p301s FRET生物传感器细胞后具有明显的种子活性。图像代表着数千个类似的细胞。蛋白质印迹至少代表三个复制品。播种试验代表一个单独的实验,每个数据点代表一个样本,分三份进行分析。误差线代表标准偏差。

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表1
由sec或截止过滤器分离的ds9单体产生的亚菌株。

tau rd-yfp单体(mS)用sec或100kd截止滤纸从DS9中分离,接种到DS1中产生亚株。分离出多个克隆,并进行形态学鉴定。列表示已标识的克隆数(n)以及它占总克隆数的百分比。无论纯化方法如何,均观察到单个亚菌株。采用盲法对细胞形态进行分类。

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S 100KD滤波器
n % n %
九点一 五十二 一百 三十一 一百
表2
用SEC或截止过滤器分离的DS10单体产生的亚菌株。

tau rd-yfp单体(mS)用sec或100kd截止滤纸从DS10中分离,接种到DS1中产生亚株。分离出多个克隆,并进行形态学鉴定。列表示已标识的克隆数(n)以及它占总克隆数的百分比。M的分离S从DS10到SEC或100 kd截止过滤器,每个都能形成相似比例的子菌株。采用盲法对细胞形态进行分类。

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S 100KD滤波器
n % n %
十点一 十九 三十六 十二 四十三
十点二 十一 二十一 十一
十点三 十三 二十
十点四 十一
10.5(扇区) 十一 二十一 十五
合计 五十三 一百 二十七 一百

我们用有限蛋白水解法比较了4个单克隆DS10菌株。(图2B)DS10和DS10.1在10kD左右表现出相似的抗蛋白酶双链,在20kD左右表现出相对较轻的带。DS10.2在10kD和20kD至25kD之间展示了谱带。DS10.3和10.4在15kd处显示了一个波段。DS10.3展示了一个10 kd的乐队,这在DS10.4中几乎没有。沉降分析有助于进一步区分菌株:DS10,DS10.1和DS10.2主要含有不溶性部分和小的可溶性部分。相比之下,DS10.3和DS10.4表现出混合溶解性,约有一半可溶和不可溶的陶蛋白(图2C)DS10菌株也有非常不同的播种效率,跨越2个对数级的浓度。(图2D)DS10和DS10.1的播种剖面几乎相同,用电子商务五十澄清溶解液为300ng。DS10.2具有EC五十10 ng。DS10.3在EC下的播种活性弱得多。五十在>10μg(无法准确测定)时,最大播种效率降低~50%。DS10.4具有EC五十100 ng。基于多种措施,我们得出结论,与DS9不同,DS10单体编码的不同亚株,每一个都有独特的形态和生化特征。

M的构象系综S

由于存在多个不同的单体,可能产生DS10的亚菌株。每一个都只能形成一个单独的子应变。在这种情况下,米S预计每个子应变只会重新产生该子应变(如DS9.1–9.6)。或者,米S源于DS10可能作为构象受限系综存在,不同状态之间的动能和能量屏障相对较低,在高阶装配时“锁定”。在这种情况下,任何子菌株的单体在重新接种后都会形成所有其他菌株。为了检验这些想法,我们从每个DS10菌株中分离出单体,将它们重新引入DS1,以及分离的n=47–51单克隆细胞系,每种接种都含有包涵体。我们用细胞内包涵体形态学的盲评分法分析了每一种包涵体。在来源于DS10.1单体的49个亚菌株中,45与DS10.1相同,除了构成DS10.5(部门)的四个(表3)这建议MS从DS10.1开始,其构造相对受到限制。我们得到了与其他DS10菌株非常不同的结果。米S源自DS10.2中的每一个,DS103或DS10.4产生所有子菌株,包括DS10.1,以原始亚应变为主(表3)这表明MS从这些DS10子串作为构象系综存在。合在一起,我们的实验表明,尽管来自总溶解物的多聚体组件在所有情况下都表现出一致的应变行为,那就是,可靠的复制,Tau单体(M)S)不那么拘束。当MS来源于DS9的菌株完全局限于形成单一菌株和M。S从DS10.1主要编码一个子菌株,其他(DS102)DS103DS10.4)采用了中定义的一组菌株,其中mS从任何一个都可能产生所有五个。

表3
从DS10获得的第二代亚菌株的量化。

S从DS10(10.1–10.5)的每个亚株接种到DS1中,并对诱导菌株的克隆进行了鉴定。DS10.1在很大程度上产生了一个与DS10.1(92%)相同的优势菌株和另一个快速分段的菌株DS10.5(8%)。DS10.2–10.4每种菌株都再现了所有其他菌株。列表示所描述的克隆数(n),以及每种情况下总克隆数的百分比。采用盲法对细胞形态进行分类。

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诱导克隆
十点一 十点二 十点三 十点四 10.5(扇区) 合计
S n % n % n % n % n % n %
十点一 四十五 九十二 四十九 一百
十点二 三十七 七十九 四十七 一百
十点三 十一 二十一 二十一 四十二 十二 二十三 五十一 一百
十点四 十七 三十五 十三 二十七 十二 二十四 四十八 一百

亚株在PS19小鼠中诱导不同的病理学。

Bona菲德tau朊病毒株产生了独特的和可预测的病理学。体内.我们以前曾用p301s突变表达全长(1N,4R)人tau的ps19小鼠进行过接种。(Yoshiyama等人,二千零七)研究菌株的病理学(桑德斯等人,二千零一十四考夫曼等人,二千零一十六)为了测试亚菌株的活性,我们接种了5个DS9的复制品,DS91,DS10,DS10.1–10.4在3ms时进入PS19小鼠的左海马。小鼠的年龄和性别尽可能匹配,来自多个独立的垃圾。接种4周后,我们用AT8抗体染色分析了小鼠的大脑。识别tau的p-ser202和p-thr205。(图3

子菌株触发p301s小鼠独特的tau病理学。

将10μg澄清溶解液注入3个月p301s小鼠的左海马,4周后进行AT8染色。冠状图像的方向是注射部位在左侧。DS9和DS9.1在CA1和CA3区域诱导了相似的病理学。DS1未诱导病理学。DS10和DS10.1在CA1和CA3中诱导了相似的病理学。在这两种情况下,我们在整个CA1的细胞体中观察到AT8染色,在整个CA3的细胞体中观察到AT8阳性点。DS10.2在CA1的细胞体和轴突中均诱导了AT8信号。CA3几乎没有病理变化。DS10.3在CA1和CA3中几乎没有诱发AT8信号。DS10.4同样在CA1区诱导了小的病理变化,而在CA3区则没有。每个图像代表五只相同处理的小鼠(每组3只雄性/2只雌性或2只雄性/3只雌性)的一个示例。我们注意到,在诱导病理学方面,男性和女性没有差异。标度条代表整个大脑200μm,CA1和CA3区域50μm。

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DS1对照组小鼠海马区无tau病理改变。CA1或CA3。DS9,DS10,各亚株均诱发不同类型的病理学改变。DS9和DS9.1在整个Ca1和Ca3中以彼此不可区分的模式诱导缠结状包裹体,与先前的观察结果一致(桑德斯等人,二千零一十四)果不其然,DS10诱导海马苔藓纤维束中AT8阳性点状突起,细胞体有强染色。在CA3中有8个阳性点。DS10.1诱导病理学在CA1和CA3中与DS10相似。DS10.2在整个CA1中诱导的缠结状包裹体,但在CA3中病理学很少或没有。DS10.3仅在CA1中具有极低的播种效率和诱导病理学。DS10.4也只有在CA1中具有低播种率和诱导病理学。一位盲评员(O.M.K.)分析了所有接种(n=40)产生的载玻片,并按组分类。DS9和DS9.1无法区分。DS10.1–10.3都很容易区分,对于DS10.4,只有一个错误,有一次被错误分类(表4

表4
注射小鼠海马AT8信号分析。

PS19小鼠在3个月时接种来自DS9和DS10的亚株到海马体(每个N=5)。8周后,由一位盲评者对海马的冠状切片进行分析,该盲评者在不同的切片上对每个克隆体的特征进行了教育。在分析40个大脑时发生了一个错误。

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接种菌株 盲法分析
DS1 DS1被正确分类。
DS9 DS9和DS9.1无法区分。
DS91
DS10 DS10和DS10.1无法区分。
DS101
DS102 DS10.2被正确分类
DS103 DS10.3被正确分类。
DS104 DS10.4正确分类4/5次,1/5错误分类为DS10.3

截然不同的MSAD和CBD大脑的构造

之前对DS9和DS10的研究是基于tau-rd-yfp融合,并且不确定来源于人类τ蛋白病变的τ单体是否同样编码菌株。我们之前已经确定了AD和CBD患者大脑中的菌株组成,这两个组分非常明显。(桑德斯等人,二千零一十四)因此,我们使用每一个代表性脑作为τ单体的来源。我们用均匀化法轻轻地溶解了大脑,以前决定不释放m的方法S来自预先存在的纤维(米尔巴哈等,二千零一十八)并用一种针对N端的抗tau抗体(HJ8.5)纯化全长tau并经sec分解单体。我们用来自AD患者的总溶解液接种DS1细胞,并恢复单个克隆形态。广告(t)。我们还使用了ad_mS由SEC分离,接种DS1细胞,恢复相同的克隆形态。广告(M)。正如我们之前观察到的(桑德斯等人,二千零一十四)每个克隆都有一个“斑点”构造,这表明我们很可能传播了一个菌株(图4A)我们还隔离了S通过一个100kd的截止滤光片和接种的ds1细胞,分离23个单克隆株。所有无性系的形态特征均与ad(t)和ad(m)相似。(表5)为了更好地描述陶蛋白,我们对来自Ad(t)和Ad(m)克隆的裂解物进行了有限的蛋白水解。这显示了相同的消化模式。(图4B)我们还使用沉降分析对它们进行了比较。来源于Ad(M)或Ad(T)的菌株,由可溶性和不溶性蛋白质组成。(图4C)细胞系的种子分析也显示出非常相似的潜能。(图4D)我们得出结论,陶姆S从广告病人编码相同的单一菌株作为总溶解液。

S从一个AD患者身上衍生出一种菌株。

)来源于总溶解液的克隆细胞系,广告(t),和MS,Ad(M)具有相同的包合形态。()由ad(t)和ad(m)衍生的rd-yfp具有相似的溶解度曲线。DS1中的rd-yfp仅存在于上清液部分中。通过超速离心将总(t)溶解物分解为上清液和颗粒(p)部分。在凝胶上的上清液对载药量的影响为1:1。C)从Ad(T)和Ad(M)克隆系中有限的蛋白水解产生了相同的带型。车道1代表DS1,由完全消化的RD-YFP单体组成。(D)AD(T)和AD(M)无性系的裂解产物具有相似的种子分布。图像代表着数千个类似的细胞。蛋白质印迹至少代表三个复制品。播种试验代表一个单独的实验,每个数据点代表一个样本,分三份进行分析。误差线代表标准偏差。

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表5
由sec或截止过滤器分离的ad单体产生的亚菌株。

Tau单体(M)S)用免疫沉淀法从AD脑中纯化,然后进行SEC或通过100kD的截止滤过。在接种到DS1细胞之前。列表示已标识的克隆数(n)以及它占总克隆数的百分比。无论纯化方法如何,均鉴定出一个单独的Ad亚株。采用盲法对细胞形态进行分类。

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S 100KD滤波器
n % n %
广告(M) 四十七 一百 二十三 一百

接下来,我们评估了来自CBD患者的总溶解物或单体的菌株。在DS1细胞转导后,总的CBD裂解液产生两种不同的菌株:CBD1(t)和CBD2(t)。米S从cbd脑中产生两种与从总溶解物cbd1(m)和cbd2(m)中获得的菌株相同的菌株,加上第三种菌株,CBD3(m)图5A表6)CBD MS也使用100 kd截止滤波器分离并转化到ds1线以产生不同的克隆。根据形态学,亚菌株的比例与使用凝胶过滤得到的菌株相似。表6)无论是来自总溶解物还是单体,来自克隆cbd1(t)和cbd1(m)的tau,或cbd2(t)和cbd2(m)表现出相似的沉积特性。(图5B)蛋白质水解模式(图5C)和播种活动(图5D)cbd3(m)形态独特,带有序集料(图5A)明显沉积(图5B)蛋白质水解模式(图5C)以及更高的播种活动(图5D

S来自CBD的患者产生三种不同的菌株。

)cbd总溶血酸克隆株有两种不同的包合模式。CBD1(t),CBD2(t)。来自CBD M的克隆系S有两种模式与总溶解液的模式相同,CBD1(m),CBD2(m),一个第三,CBD3(m)。()cbd1(t)和cbd1(m)的rd-yfp具有混合溶解性。在cbd2(t)和cbd2(m)中,大多数RD-YFP存在于上清液中。CBD3(M)与大部分RD-YFP在不溶性组分中具有混合溶解性。通过超速离心将总溶解物分解为上清液和颗粒物。所有样品上清液对凝胶颗粒的比例为1:1。车道1代表DS1,由完全消化的RD-YFP单体组成。(C)cbd1(t)和cbd1(m)的rd-yfp聚集物表现出相似的蛋白水解模式。抗蛋白酶带约为10-15kd,强力带约为15kd。从cbd2(t)和cbd2(m)中对rd-yfp的蛋白水解只产生一个约15kd的强带。cbd3(m)有一个独特的蛋白水解模式,大约10-15kd。(D)从克隆cbd1(t)裂解,CBD1(m),cbd2(t)和cbd2(m)具有相似的播种剖面,而来自CBD3(M)的裂解液具有更强的播种活性。图像代表着数千个类似的细胞。蛋白质印迹至少代表三个复制品。播种试验代表一个单独的实验,每个数据点代表一个样本,分三份进行分析。误差线代表标准偏差。

https://doi.org/10.7554/188bet体育电竞elife.37813.014
表6
由SEC或截止过滤器分离的CBD单体产生的亚菌株。

S通过免疫沉淀、SEC或通过100kd的截止滤光片从CBD脑中纯化。在接种到DS1细胞之前。CBD子菌株,CBD1-3(m),被量化。M的分离S通过sec或截止滤波器从cbd脑中分离出相似比例的亚菌株。列表示已标识的克隆数(n)以及它占总克隆数的百分比。米S无论过滤方法如何,都会产生类似的应变模式。采用盲法对细胞形态进行分类。

https://doi.org/10.7554/188bet体育电竞elife.37813.016
S 100KD滤波器
n % n %
CBD1(m) 二十 三十六 二十二
CBD2(m) 十八 三十三 三十九
CBD3(m) 十七 三十一 三十九
合计 五十五 一百 十八 一百

我们得出的结论是SCBD可以由三个独立的种子活性单体组成,或者它可以在形成特定结构的更大组件之前占据一个有限的构象系综。在第一种情况下,我们预测MS三个CBD子菌株中的每一个都只能产生母体菌株。相反地,如果构象系综能形成三种不同的菌株,然后MS从CBD的任何一个子菌株中,都会重现整个面板。我们从三个CBD亚株中分离出单体,重新接种DS1,并对所得克隆进行形态学评价。米S源于每一亚株cbd1优先编码母株,还有另外两个(表7)这些数据表明S源于cbd的构象集合(类似于ds10)编码了一个定义的菌株子集。相反地,米S来源于AD患者的构象状态更为受限,只编码一个菌株。

表7
CBD衍生子菌株菌株的量化。

用每一个CBD亚株衍生的单体RD-YFP接种DS1。然后用形态学对所得克隆进行表征。米S从每一个亚菌株中重新创造出这三个亚菌株,对原种的偏好。列表示识别的克隆数(n)和占总克隆数的百分比(%)。使用盲分析对细胞形态进行分类。

https://doi.org/10.7554/188bet体育电竞elife.37813.017
诱导克隆
CBD1 CBD2 CBD3 合计
输入MS n % n % n % n %
CBD1(m) 三十 五十七 十五 二十 四十七 一百
CBD2(m) 十七 二十九 六十二 二十 四十八 一百
CBD3(m) 十三 二十六 十一 二十三 三十一 六十 五十五 一百

讨论

我们以前定义过两个tau:m构象系综。,它是惰性的,和MS,可自行装配播种(米尔巴哈等,二千零一十八)单体tau是否编码菌株信息尚不清楚,或者如果这是由多聚体组件决定的。我们现在得出结论S表示一组结构,in,每个结构编码一组有限的菌株。米S来源于人工衍生菌株(DS9和DS10),仅复制母体菌株(DS9)。或一系列的亚菌株,其中一个与母体菌株(DS10)非常相似。这些子菌株在接种到PS19τ蛋白病变小鼠模型后均产生独特的病理学。转向患者来源的样本,我们观察到,就像总的大脑溶解物,米S从一个AD患者身上编码了一个菌株。相反地,当来自CBD患者的总溶解物编码两种菌株时,米S来源于cbd裂解物编码这两个菌株,加第三。因此,我们假设Tau,尽管传统的生物物理测量方法没有结构化,可以采用多个,稳定的构象集合,以种子的形式存在,米S.这些可能会限制随后的装配为单个纤维构造(如MS源自DS9和AD)或者能够形成构成单个应变的有限数量的装配结构(对于MS源自DS10和CBD)。

有趣的是,DS10单体产生5个亚菌株。DS10.1在各个方面都与DS10相似,除此之外,该亚菌株的单体并未重现DS10单体中的原始多样性。这表明在形成DS10.1时,米S采用与DS10单体结构非常相似的结构,但有能量或动能障碍限制其构象。在隔离M时S从DS10我们启用了一个新的,限制性MS在DS10.1应变中出现并被捕获的构象。尽管如此,DS10和DS10.1在包体形态上的总体相似性,播种活动,蛋白质水解模式,神经病理学表明,核心淀粉样蛋白的构象几乎是相同的。

这项工作的一个重要警告是,我们使用含有两个突变(p301l/v337m)的tau rd-yfp来扩增菌株。不是全长蛋白质。我们认识到,我们的系统可能会偏向于菌株的检测。也,RD-YFP是否捕获了患者体内出现的纤维的关键核心结构尚待确定(研究还在进行中)。例如,Fitzpatrick等人的前期工作提示AD脑中可检测到两种不同的纤维形态(成对螺旋丝和直丝)。(Fitzpatrick等人,二千零一十七)这些似乎来源于单体模板的不同配置。这与我们之前的工作是一致的,我们分析的2/6名AD患者含有两种不同的菌株,而在4/6的病人中,我们观察到一个菌株(桑德斯等人,二千零一十四)尽管如此,基于我们对源于M的菌株的鉴定S从广告和CBD大脑中提取,我们对我们的初步结论充满信心。在这方面,我们很高兴看到Ohashi等人最近的研究,世卫组织发现SUP35的固有无序区域具有局部致密结构,另外,单体的不同形式也会产生独特的SUP35淀粉样结构。(OHHASHI等,二千零一十八

基于这项工作,我们预测相关的“家族”菌株将在患者中描述,通过结构相似性连接(图6)更具体地说,我们假设菌株家族将利用不同的氨基酸组合形成局部的“核心”结构,这些结构大部分被保存下来,甚至在单体中。同样地,种子活性单体将采用一系列结构相关的构象,进一步组装成淀粉样纤维。一旦一个多聚体组合形成,我们的观察表明它作为一种菌株忠实地复制。这就解释了一个病人可能携带多种菌株,每一个都可能来自一个拓扑受限的τ单体系综,米S.延伸,每一种不同的互变异都可能基于M的限制性构象的出现而发展。S.这可能是由于随机或环境影响,翻译后修饰,或其他促进m转换的相互作用。到一个特别的M合奏团S构象。

单体构象族模型。

我们提出了一个区分两个一般构象系综的模型:M和MS.米是惰性的,而MS有播种活动。米内S,存在可编码单个或多个菌株的多个构象。一旦一个组件形成,菌株将被忠实地复制;然而,如果MS与菌株分离,它可以组合成一组确定的子菌株。

网址:https://doi.org/10.75188bet体育电竞54/elife.37813.018

综上所述,我们提出了一个模型来解释不同的聚集结构是如何形成的,并在陶蛋白病变中引起表型多样性。这预示着一个家庭受限的MS具有不同程度关联性的结构合奏。M的原始拓扑约束S会产生_头朊病毒株,以及它们引起的疾病,因此,最终可能取决于τ单体的初始构象决定因素。最终,了解不同陶蛋白病变的构象基础有助于更准确的诊断和治疗。

材料和方法

关键资源表
试剂 任命 来源 标识符 附加信息
基因
(人)
陶路
(LM)-YFP
PMID:24857020
细胞系
(人)
DS1;DS9;DS10 PMID:24857020
细胞系
(人)
陶氏路P301S
FRET生物传感器
PMET: 25261551,
美国标准菌库
ATCC CRL 3255,
RRID:CVCL
细胞系
(人)
DS91;
DS101;
DS102;
DS103,DS104,
广告(t);广告(M);
CBD1(t);CBD2(t);
CBD1(m);CBD2(m);
CBD3(m)
本文 这些是细胞
创建的线
来自τ种子
(总裂解物)
和/或
种子合格
单体)衍生
要么来自克隆
细胞系DS9
和DS10,或
阿尔茨海默氏症
皮质基底的
变性疾病
脑标本
接种过疫苗的
进入DS1细胞系,
如上所述
材料和
方法,和
结果部分。
抗体(兔) taua(多克隆抗
qtap…基斯滕)
本文 抗体使用
稀释时
表示在
材料及
方法
截面(1:1000)。
抗体(兔) 抗绿色荧光蛋白
(多克隆)
罗克兰公司 洛克兰
抗体:
600—401-215,
RRID:ABA88167
抗体用于
显示稀释度
在材料和
方法断面
(1:1000)
抗体(小鼠) HJ 9.3(单克隆
抵头路
PMET: 24075978,
PMID:29566794
RRID:ABA2221235 抗体用于
显示稀释度
在材料和
方法断面
(1:2000)
抗体(驴) ECL
抗兔
GE生命科学 N9340V, 抗体
稀释时使用
表示在
材料及
方法
部分
(1:2000)
抗体(绵羊) ECL
抗小鼠

生命科学
N931 抗体用于
显示稀释度
在材料和
方法断面
(1:2000)
商业广告
化验
阿美沙姆ECL
蛋白质印迹法
试剂

生命科学
通用电气生命科学:
RPN2266
商业广告
化验
100 kd旋转过滤器 科宁
自旋X超铀
康宁:431481
商业广告
化验
琼脂糖
皮尔斯蛋白质
A/G加
热的
费雪:20423
软件 图形板
棱镜
图形板
软件有限责任公司
软件 弗洛乔 弗洛乔有限责任公司
其他 脂多糖胺
二千
热磨机 热的
费希尔:11668019
转染
试剂

细胞培养

所有细胞都生长在添加了10%胎牛血清(hyclone)的dulbecco改良Eagle's培养基(gibco)中。1%青霉素/链霉素(Gibco)和1%谷氨酰胺(Gibco)。细胞保持在37°C,5%二氧化碳,在加湿的培养箱中。

脂质体介导的tau种子转导

在96孔板中以每孔30000个细胞的密度电镀稳定的细胞系。18小时后,60%的冲突,细胞被蛋白质种子转导。通过将[11.75μl opti mem(gibco)+0.75μl lipofectamine 2000(invitrogen)与细胞溶解物以25μl/孔的总体积结合来制备转导复合物。脂质体复合物在室温下培养20分钟,然后加入细胞。细胞用转导复合物培养48小时。

单克隆细胞分离

利用脂质体介导的tau种子转导,用澄清的裂解液和单体处理ds1细胞。48小时后,收集细胞并将其重新悬浮在流动缓冲液中(1XHBSS,1%磅,1毫米EDTA)。使用Facs-aria II SORP细胞分类器,根据其特别明亮的YFP信号来鉴定含有聚集物的细胞。将细胞单独分为96孔板,培养至融合形成克隆系。稳定维持集料的生产线被移到更大的板上,并被放大以便进一步研究。

蛋白质印迹法

细胞颗粒在冰上融化,在含有0.05%Triton-X和一个完整的迷你蛋白酶抑制剂片(Roche)的PBS中通过研磨溶解,在500 x g和1000 x g条件下,通过5分钟连续离心澄清。用Bradford法(Bio-Rad)测定澄清溶血酸的总蛋白浓度。将澄清的裂解液与2X SDS缓冲液(最终SDS浓度4%)混合,在NIPUAGE 4 - 12%双TIS凝胶上在150 V下运行75~min。然后用半干传输装置(BIO RAD)在20V下将凝胶转移到固定的P膜上1小时。然后用5%的非脂肪干乳在TBST中封闭膜1小时,然后使用原代兔抗tau单克隆抗体在1:1000时加入针对qtap…kigstenl)的混合物,并在4°C下将其置于摇壶中过夜。然后每隔10分钟用TBST清洗膜四次。然后在室温下用山羊抗兔次级抗体对膜进行1.5小时的重新探测。然后用TBST清洗膜四次。最后,将膜暴露于ECL Prime Western Blot检测试剂盒(GE Lifesciences)中2分钟,并用syngene数字成像仪成像。图像代表至少三个相似的复制品。

超声波和粒度排除色谱法

使用Q700声波仪(qsonica)在4°C下以100–110瓦特(振幅50)的功率对澄清的溶血酸盐进行声波处理1小时。然后将样品在21000 x g下离心10分钟,将1 ml上清液装入Superdex 200递增10/300 gl柱(GE Healthcare),并在4°C的PBS缓冲液中洗脱。使用平板阅读器(Tecan M1000)用Bradford分析法测量每个部分的蛋白质含量后,我们在−80°C下对样品进行标定和储存,直到进一步使用。每一等分试样在使用前立即解冻。通过运行凝胶过滤标准(Bio-RAD):Thyroglobulin(牛)670 kD/845纳米,估算各馏分中蛋白质的分子量/回转半径;γ-球蛋白(牛)158kd/5.29nm;卵清蛋白(鸡)44 kd/3.05 nM;肌红蛋白(马)17 kd/2.04 nM;维生素B十二1.35 kd/0.85牛米。

尺寸截止过滤

根据制造商的指示,SEC的单体部分通过100 kDa mwco过滤器(康宁)(在4°C下以15000 x g的速度离心15分钟)。立即收集过滤材料并测定蛋白质浓度。将滤液标定并冷冻在−80°C。

单体分离

澄清的溶血酸以186000 x g的速度超速离心1小时,然后用1毫升PBS清洗颗粒。样品再次以186000 x g的速度超速离心30分钟,然后吸出上清液。将颗粒重新悬浮在200μl PBS中。然后使用Q700声波仪(qsonica)在4°C下以100–110瓦特(振幅50)的功率对颗粒进行声波处理1小时。然后将样品在21000 x g下离心10分钟,将1 ml上清液装入Superdex 200递增10/300 gl柱(GE Healthcare),并在4°C的PBS缓冲液中洗脱。用BSA法定量洗脱液。单体组分在不含脂质体的情况下不显示种子,但在其存在下显示种子(数据未显示)。

快速流式细胞仪

tau p301s生物传感器细胞(rrid:CVCL)用0.05%胰蛋白酶收获,用2%多聚甲醛(电子显微镜)固定10分钟。然后在流式细胞仪缓冲液中重新悬浮。用Macsquant VYB(Miltenyi)进行了快速流式细胞仪检测。测量CFP和FRET,细胞被405纳米激光激发,用405/50纳米和525/50纳米滤光片捕获荧光,分别。衡量YFP,用488nm激光激发细胞,用525/50nm滤光片检测荧光。要量化FRET,我们使用了一种与前面描述的类似的选通策略。(福尔摩斯等人,二千零一十四)用FRET阳性率测定含聚集物细胞的比例。对于每个实验,分析大约10000个细胞,一式三份。使用Flowjo V10软件(Treestar)进行分析。误差线代表标准偏差。

蛋白酶消化

将pronase(roche)在PBS中稀释至1 mg/ml的最终浓度,并将一次性等分样品储存在-80°C下。如前所述制备澄清的细胞裂解液,蛋白质浓度标准化为4μg/μl,除非另有说明。将40μg(10μl)的细胞裂解液以60μg/ml的浓度(在PBS中稀释)添加到10μl的pronase中,最终体积为20μl,最终pronase浓度为30μg/ml。细胞溶解物在37°C下消化90分钟。通过添加20μl 2X样品缓冲液(最终SDS浓度为4%)和煮沸5分钟来骤冷反应。每个样品的15μL被加载到10%双三肽凝胶(Novex通过Life Technologies),在150 V下运行65分钟。使用半干转移装置(Bio-Rad)将蛋白质转移到不动植物P(Millipore),如上文所述探测膜的τRd。

沉降分析

如前所述制备澄清的细胞裂解液。将10%的裂解液留作总分数;其余的以186000 x g的速度离心1小时。将上清液放在一边,用1毫升PBS清洗颗粒,然后以186000 x g的速度超速离心30分钟。从该步骤中抽取上清液/洗涤液,并通过在4%SDS和100 mm DTT的Ripa缓冲液中煮沸重新悬浮颗粒。用BSA标准曲线法(Bio-Rad)对所有蛋白质浓度进行归一化。在4 - 12%双TIS凝胶中,每孔装载1μg总蛋白。对于所有样品,上清液与颗粒的比例均为1:1。用蛋白质印迹法分析凝胶。

共聚焦显微镜

96孔板(Costar 3603)涂有1X聚赖氨酸(PDL)。在37°C下培养过夜。然后用PBS清洗平板,将细胞电镀并在DMEM培养基中培养24小时。然后取出培养基,用4%PFA替换10分钟。去除PFA,用PBS洗涤2次,然后用DAPI在0.05%Triton-X中染色10分钟。细胞被清洗并储存在PBS中。在UTSW高通量筛选核心设施的协助下,用细胞内分析仪6000以40倍分辨率对平板进行成像。对图像进行编码,并对聚集形态进行盲计数。对环境视而不见。

动物接种实验用细胞裂解液的生产

细胞系在10厘米培养皿中生长,直到80%的细胞融合。然后清洗细胞,胰蛋白酶化的,再悬浮于培养基中,以1000 x g的速度离心。用PBS洗涤细胞颗粒。然后将颗粒储存在−80°C下。分析前,将颗粒在冰上解冻,然后用完全蛋白酶抑制剂(Roche)重新悬浮在1X PBS中,并使用Omni-ruptor 250探针声波仪在40%功率下对其进行声波处理35×3 s循环。探头用10%漂白剂清洗,100%乙醇和DDHo细胞系之间。然后以1000 x g的速度离心菌株,通过Bradford分析(Bio-Rad)归一化为7μg/μl,并在−80°C下以等份形式存储。

动物养护

我们获得了在小鼠朊病毒启动子下表达4R1n p301s人tau的转基因小鼠。(Yoshiyama等人,二千零七)杰克逊实验室,并将其保持在B6C3背景下。转基因小鼠和野生型幼仔被置于12小时的光/暗循环中,提供食物和水随意地.所有涉及动物的实验都得到了德克萨斯大学西南医学中心机构动物护理和使用委员会的批准。

小鼠脑接种

用异氟醚麻醉p301s小鼠,并在整个接种过程中保持在37°C。以0.2μl/min的速率分别向小鼠注射10μl气密汉密尔顿注射器。给动物接种10μg(1.428μl)的左海马细胞溶解物(来自Bregma:−2.5 mm后,-2 mm横向,-腹侧1.8毫米)。然后让动物在组织收集前恢复并监测40天。

动物组织收集

用异氟醚麻醉p301s或wt小鼠,并用冷冻的PBS+0.03%肝素灌注。大脑在4℃下在4%多聚甲醛中过夜固定,然后放入30%的蔗糖中PBS,直到进一步使用。

组织学

用冷冻切片机在50μm处对大脑进行切片。切片首先用5%非脂肪干牛奶在0.25%Triton X-100(封闭缓冲液)的TBS中封闭1小时。对于DAB染色,用生物素化的AT8抗体(1:500,Thermo Scientific)在4°C的阻挡缓冲液中过夜。切片随后用Vectastain Elite ABC试剂盒(载体实验室)在根据制造商方案制备的TBS中培养30分钟,随后,使用带有可选镍添加的DAB过氧化物酶底物试剂盒(载体实验室)开发DAB。切片用奥林巴斯纳米变焦仪2.0-HT(Hamamatsu)成像。

工具书类

  1. 十一
  2. 十二
  3. 十三
  4. 十四
  5. 十五

判决书

  1. 哈里托尔
    审查编辑;明尼苏达大学美国
  2. 安娜阿克马诺娃
    高级编辑;乌得勒支大学荷兰

为了提高透明度,188bet体育电竞eLife包括编辑决定书和随附的作者回复。显示了同行评审后发送给作者的信的一个经过轻微编辑的版本,表示最实质性的关切;通常不包括次要评论。

感谢您提交您的文章“tau单体编码菌株”供考虑188bet体育电竞.你的文章已经过三位同行评审,评估由审查编辑和高级编辑安娜·阿赫玛诺娃监督。以下参与审查您提交材料的个人同意透露其身份:Jeffery W Kelly(审查员2)。

评审员互相讨论评审,评审编辑起草了这一决定,以帮助您准备修订后的提交文件。

总结:

本报告支持tau单体包含信息的概念,这些信息将为特定类型的tau聚集物播种。在本手稿中被指定为“tau株”。该报告是先前报告的延伸,表明从纤维中释放的单体可以保留促进播种能力的结构特征,从而得出tau单体要么具有播种能力(mS)或播种惰性(m)重要的是陶姆S保留产生不同细胞tau组件的额外结构信息。这可能是一个革命性的想法,对理解陶蛋白病变以及与蛋白质聚集相关的其他疾病的结构基础有重大影响。

基本修订:

1)当作者使用几种方法来减少潜在污染时,使用细胞源性材料会造成一些并发症。例如,如果潜在的“可溶性”低聚物在细胞内被蛋白质水解处理,使用100kda截止过滤器的过滤不能去除任何“加工”的低聚物。虽然人们可以尝试检测这种“寡聚物”,但如果寡聚物的水平非常低,这种努力就会受到挑战。一个建议是看看含有“单体”的yfp的耗尽是否会显著降低克隆体中单体的“播种”能力。虽然这并不完美,至少作者可以排除任何含有“tau-rd”结构域的假低聚物。

2)在本报告中使用“应变”表示直接结构决定因素。本报告的结果完全基于“聚集物”的大体细胞形态和tau病理学的神经解剖学分布。除细胞源性物质的蛋白酶敏感性分析外,没有证据表明菌株在结构上是不同的。例如,细胞衍生单体是否直接在体外培育具有不同结构/形态的tau纤维聚集物?

3)在手稿的各个地方,他们认为陶是一种朊病毒。陶还不应该被视为朊病毒,因为tau仍然缺乏一些对朊病毒进行分类的属性。最重要的是,没有流行病学数据表明tau聚集物在人类个体间的遗传性。只要tau不满足所有对prions分类的标准,它不应该被指定为朊病毒。

https://doi.org/10.7554/188bet体育电竞elife.37813.022

作者反应

基本修订:

1)当作者使用几种方法来减少潜在污染时,使用细胞源性材料会造成一些并发症。例如,如果潜在的“可溶性”低聚物在细胞内被蛋白质水解处理,使用100kda截止过滤器的过滤不能去除任何“加工”的低聚物。虽然人们可以尝试检测这种“寡聚物”,但如果寡聚物的水平非常低,这种努力就会受到挑战。一个建议是看看含有“单体”的yfp的耗尽是否会显著降低克隆体中单体的“播种”能力。虽然这并不完美,至少作者可以排除任何含有“tau-rd”结构域的假低聚物。

审核员提出了一个相关问题,即在ds细胞中,是否裂解缺乏大体积gfp的tau-rd裂解产物可以包含tau-rd片段,它在14kDa处可以形成穿过100kDa过滤器的神秘多聚体,否则对我们的分析是不可见的。为了解决这一问题,我们使用HJ9.3从DS10.2细胞裂解液中沉淀了种子活性(因为我们发现使用抗gfp抗体不可能获得IP种子)。HJ9.3免疫沉淀整个种子活性(作者响应图像1

作者响应图像1
DS10.2种子活性的免疫沉淀。

来自以聚集形式表达tau-rd-yfp的ds10.2细胞的裂解液暴露于hj9.3抗体,它识别了tau aa306-321,然后免疫沉淀。总计,上清液,通过脂质体将颗粒部分转化为tau-rd-cfp/yfp-fret生物传感器细胞。用流式细胞仪测定细胞聚集率。暴露于抗tau抗体后,上清液中没有播种活动,所有的都被移到了颗粒部分。

为了测试缺乏GFP表位的RD片段是否能解释菌株的活性,我们用HJ9.3探测了蛋白质印迹,抗gfp抗体。我们用每种抗体检测出两条带。(作者响应图像2)主宰乐队,约45kda与全长rd-yfp一致。hj9.3和抗gfp抗体都检测到一个较小的约35kDa带。(作者响应图像2)我们没有观察到反应性与仅Rd的解理产物一致的条带(接近于14kDa)。并行地,我们对AD大脑中的tau单体进行了研究,哪一个,像RDYFP一样,携带应变信息。我们没有观察到tau-rd片段的证据。

作者响应图像2
DS10.2中的τ单体主要为全长。

图中显示了tau rd-yfp和hj9.3的表位。最初是用的

免疫沉淀(IP)。遵循IP,执行了SDS-PAGE,然后用hj9.3(左)或抗gfp(右)的二级抗体进行Western blot。HEK细胞裂解液为阴性对照。同时对AD脑溶解物进行了分析。约45kDa处的Tau Rd-Yfp是主要波段,二次带(只是偶尔观察到,但记录在这里)大约35kDa,包含gfp表位和hj9.3表位。值得注意的是,衍生自Ad Brain(也编码菌株)的τ单体没有明显的截断产物。 作者响应图像2标题/传奇>

综上所述,虽然我们不能排除少数tau的不可见rd低聚物编码细胞系内菌株的可能性,我们的生化研究表明tau单体作为完整的rd-yfp的主要形式,对于小部分样品的次要产品(以及,的确,当我们进行重复研究时并不总是可见),它同时包含Rd和Yfp表位。最后,关于我们手稿的中心点,我们没有观察到全长tau片段能够解释编码种子活动的菌株,正如隐晦单体预测的那样,所以我们坚持我们的中心结论。

2)在本报告中使用“应变”表示直接结构决定因素。本报告的结果完全基于“聚集物”的大体细胞形态和tau病理学的神经解剖学分布。除细胞源性物质的蛋白酶敏感性分析外,没有证据表明菌株在结构上是不同的。例如,细胞衍生单体是否直接在体外培育具有不同结构/形态的tau纤维聚集物?

评论家提出了一个困扰朊病毒研究领域的有效观点,尽管我们强烈反对这种说法,即我们提供了“没有证据”证明菌株在结构上是不同的——我们使用了包涵体形态,播种活动,生化特性,体内接种,以及有限的蛋白水解。这些共同代表了一个相当全面的,如果是间接的,对朊病毒形态的评估,或应变特性。事实上,我们要强调的是,我们所做的工作超过了PRP研究中用来区分菌株的典型工作。目前在我们实验室是不可能的(在其他实验室,据我们所知)在体外忠实地扩增一个tau-prion菌株。因此,我们只剩下上述“间接”结构探针,其中最好的似乎是有限的蛋白质水解。当我们处理这个问题的时候,到目前为止,我们还没有开发出一种直接测定tau-prion菌株构象的方法。在我们的实验专长的限制下,我们可以安全地得出结论,我们实际上产生了不同的菌株。值得一提的是,在我们对二十多个不同菌株的分析中,我们从未观察到具有不同细胞形态模式(我们最初用来选择不同菌株)的菌株具有相同的菌株。相反,情况并非如此。具有相似包涵体形态的细胞实际上可以包涵不同的菌株。所以,如果有的话,用细胞形态作为探针低估不同菌株的流行率。

3)在手稿的各个地方,他们认为陶是一种朊病毒。陶还不应该被视为朊病毒,因为tau仍然缺乏一些对朊病毒进行分类的属性。最重要的是,没有流行病学数据表明tau聚集物在人类个体间的遗传性。只要tau不满足所有对prions分类的标准,它不应该被指定为朊病毒。

审稿人对我们使用“朊病毒”一词提出了一个有效而普遍的批评。即使是斯坦利·普鲁辛纳,谁发明了这个术语,现在在他的作品中把陶称为“朊病毒”。在2014年出版的《神经元》杂志上,我们进行了一系列实验,我们认为这些实验是确定tau是一个真正的,传染性朊病毒。我们通过体外纤维化反应创造了感染性tau,接种细胞系,分离出在体外稳定繁殖可传播tau物种的不同菌株,并通过脑接种在三代小鼠模型中创造了可传播的病理学。在我们看来,“在野外”缺乏观察到的人类遗传性,并不是对tau-prions使用不同术语的原因,在实验室环境中的各个方面,它们都符合研究和传播prp朊病毒几十年的标准。

我们还将指出,如果没有诸如极端农业实践(例如把羊的内脏喂给牛)通过组织移植或脑外科手术进行食人和接种,即使是人类的prp疾病也不会在个体之间自发传播。既然有了常识的做法,基本上就没有人传播prp-prion疾病。谢天谢地,没有已知的tau通过组织移植或脑部手术传播的病例,虽然没有这种人与人之间的转移(这可能会使审查者认为tau是朊病毒)并不意味着没有发生,或者不会发生。当然,我们先前在小鼠中传播tau病理学表明,在不幸的情况下,个体间传播是可行的。

综上所述,我们恭敬地请求保留这一条款,就所有实际目的而言,我们认为tau符合生化,生物的,以及朊病毒的实验标准。

网址:https://doi.org/10.75188bet体育电竞54/elife.37813.023

文章和作者信息

作者详情

  1. 阿普拉瓦·M·夏尔马

    1. 阿尔茨海默病和神经退行性疾病中心,德克萨斯大学西南医学中心,达拉斯美国
    2. 生物化学研究生课程,生物和生物医学科学部,圣路易斯华盛顿大学圣路易斯,美国
    贡献
    概念化,监督,起草原稿,项目管理,写作评论与编辑
    竞争性利益
    未宣布竞争利益
    奥西德图标 “此orcid id标识本文作者:”0000-0002-6526-3747号
  2. 塔利莎·托马斯

    阿尔茨海默病和神经退行性疾病中心,德克萨斯大学西南医学中心,达拉斯美国
    贡献
    概念化,数据规约,形式分析,调查,方法论,起草原稿,写作评论与编辑
    竞争性利益
    未宣布竞争利益
  3. 达纳埃尔伍德

    阿尔茨海默病和神经退行性疾病中心,德克萨斯大学西南医学中心,达拉斯美国
    贡献
    数据规约,形式分析,调查,方法论
    竞争性利益
    未宣布竞争利益
  4. 奥玛尔·M·克什默

    阿尔茨海默病和神经退行性疾病中心,德克萨斯大学西南医学中心,达拉斯美国
    贡献
    形式分析,调查,方法论,起草原稿
    竞争性利益
    未宣布竞争利益
  5. 马克一号钻石

    阿尔茨海默病和神经退行性疾病中心,德克萨斯大学西南医学中心,达拉斯美国
    贡献
    形式分析,调查,方法论,写作,资金收购
    用于通信
    marc.diamond@utwestern.edu邮件
    竞争性利益
    未宣布竞争利益
    奥西德图标 “此orcid id标识本文作者:”0000-0002-8085-7770号

基金

国家卫生研究院(1R01NS071835)

  • 马克一号钻石

国家卫生研究院(R01NS089932)

  • 马克一号钻石

雨水慈善基金会(TAU财团)

  • 马克一号钻石

资助者在研究设计中没有作用,数据收集和解释,或者决定将作品提交出版。

确认

我们感谢苏霍布纳·巴特拉尔,Dana Dodd卢卡斯·约阿希米亚克,Hilda MirbahaVictor ManonWilliam Russ芭芭拉·斯托普辛斯基,杰米·沃克·艾丽西亚,以及艾米·兹维兹乔夫斯基·扎拉特的评论。这项工作得到了tau财团的资助和NIH对1R01NS071835(MID)的资助。R01NS089932(中)。我们感谢Bruce Posner管理的高通量筛选核心(HTS)的帮助,博士学位。人体组织样本由加利福尼亚大学的神经退行性疾病大脑库提供。旧金山。

伦理学

动物实验:本研究严格按照国家卫生研究院实验动物护理和使用指南中的建议进行。所有动物均按照德克萨斯大学西南医学中心批准的机构动物护理和使用委员会(IACUC)协议(2015-100975)进行处理。

高级编辑

  1. Anna Akhmanova乌得勒支大学荷兰

审阅编辑器

  1. Harry T Orr明尼苏达大学美国

出版历史

  1. 收到日期:4月25日,二千零一十八
  2. 接受日期:11月9日二千零一十八
  3. 发布的记录版本:12月11日,2018(第1版)

版权

2018,夏尔马等人。

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韵律学

  • 一千一百六十二
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  • 二百三十九
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  • 引文

通过在以下来源中轮询最高计数生成的文章引用计数:交叉裁判公共医学中心斯科普斯.

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