1. 进化生物学
  2. 遗传学和基因组学
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预测糖基转移酶促进鞭毛虫发育和防止假细胞聚集S.罗塞塔

  1. 劳拉-韦泽尔
  2. 泰拉C列文
  3. 瑞安·E·哈利特
  4. 陈晓东
  5. 授予国王
  6. 珊瑚礁
  7. 戴维展位
  8. 莫妮卡·阿贝丁·西格
  9. 妮科尔国王 是通讯作者
  1. 加利福尼亚大学伯克利美国
  2. 霍华德休斯医学院,加利福尼亚大学伯克利美国
研究进展
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引用本文AS:188bet体育电竞Elife 2018;7:E41482 DOI:10.7554/188bet体育电竞ELIFE.41482

摘要

在以前的研究中,我们建立了鞭毛虫的前向遗传学。罗塞塔萨尔皮戈卡并发现C型凝集素基因是玫瑰发育所必需的(Levin等。,2014)。在这里,我们报告了在S.罗塞塔同时也研究了莲座丛缺陷突变体的遗传基础,其中单细胞不能发育成有序的莲座丛,而是杂乱无章地聚集成无定形的细胞团。两个突变体,杂碎和蒸粗麦粉,定位于编码两种不同预测糖基转移酶的基因病变,并在基底细胞外基质(ECM)中显示异常糖基化模式。在动物中,糖基转移酶塑造富含多糖的ECM,调节整合素和钙粘蛋白活性,而且,中断时,有助于肿瘤的发生。预测糖基转移酶促进正常玫瑰花结发育和阻止细胞聚集的发现S.罗塞塔提示糖基转移酶在调节发育和预防异常肿瘤样多细胞中的前后生动物作用。

网址:https://doi.org/10.75188bet体育电竞54/elife.41482.001

介绍

动物从单细胞祖先进化到多细胞是必不可少的。(萨瑟姆·瑞和史密斯,一千九百九十五)。然而,尽管多细胞性是动物起源的中心,对于促成动物茎系多细胞进化的遗传和发育机制知之甚少。所有现代动物都是通过连续的细胞分裂来克隆发育的,这表明他们最后的共同祖先也是如此。动物的近亲,鞭毛虫,克隆发育成多细胞莲座丛,更遥远的亲戚,如奥兹扎基辣椒Seb_peder_s等人,二千零一十三盘基网柄菌邦纳一千九百六十七Brefeld一千八百六十九)通过细胞聚集成为多细胞生物(容易被欺骗)(Santorelli等人,二千零八Strassmann等人,二千)。这就提出了一个普遍的问题,即干动物是如何抑制细胞聚集而有利于克隆多细胞发育的。

尽管第一批动物在6亿年前进化了,研究鞭毛虫可以重建动物起源的重要方面。(布鲁内和金,二千零一十七国王等人,二千零八Ruiz Trillo等人,二千零八Shalchian-Tabrizi等人,二千零八Seb_peder_s等人,二千零一十七)。罗塞塔萨尔皮戈卡是一种新出现的模式鞭毛虫,从自然界中分离出来的球形细胞群称为莲座丛。在标准实验室条件下,S.罗塞塔以单细胞或线性链聚集体的形式增殖,容易分裂成单细胞。(Dayel等人,二千零一十一)。当暴露于由共分离的猎物细菌产生的玫瑰花结诱导因子(RIF)时马基蓬藻,S.罗塞塔相反,通过连续的细胞分裂过程发展成高度组织和结构稳定的玫瑰花结。(阿列加多等,二千零一十二Dayel等人,二千零一十一Fairclough等人,二千零一十沃兹尼卡等,二千零一十六)。最近的进展,包括一个测序的基因组(Fairclough等人,二千零一十)性阶段的发现S.罗塞塔能够控制交配的生命周期(莱文等人,二千零一十四莱文和金,二千零一十三沃兹尼卡等,二千零一十七)以及允许转基因和表达的技术。(布斯等人,二千零一十八)使越来越多的分子机制的研究成为可能。S.罗塞塔.

在第一个基因筛选中,鉴定在S.罗塞塔,恢复了多个表现出一系列表型的玫瑰花结缺陷突变体。(莱文等人,二千零一十四)。第一个详细描述的突变体被命名为Rosetteless;在有RIF的情况下,无花细胞没有发育成玫瑰花结,它们在其他方面与野生型细胞不可区分。(莱文等人,二千零一十四)。无花型表型的突变被定位到C型凝集素,由基因编码罗斯特莱斯第一个基因被证明是形成玫瑰花结所必需的。(莱文等人,二千零一十四)。在动物中,c型凝集素在促进发育和先天免疫的信号传导和粘附中的作用(坎比等,二千零五Geijtenbeek和Gringhuis,二千零九Ruoslahti一千九百九十六斯瓦杰格等人,二千零一十泽伦斯基和格雷迪,二千零五)。尽管分子机制玫瑰花结调控玫瑰花结的发育尚不清楚,无花蛋白质在莲座丛内部的定位表明它作为细胞外基质(ECM)的一部分发挥作用。(莱文等人,二千零一十四)。

在这里,我们报告了从原来的玫瑰花结缺陷筛选出的最大类型的突变体。(莱文等人,二千零一十四)所有这些都没有发展成有组织的玫瑰花结,而是形成大的,无定形的细胞团,不论是否存在RIF。通过绘制凝块下的突变图,本类两个突变体的玫瑰花结缺陷表型,我们鉴定了两个预测的糖基转移酶基因,每个基因对正确的玫瑰花结发育都是必要的。导致突变的原因导致了基础ECM糖基化模式的类似干扰。预测糖基转移酶对玫瑰花结发育的重要性,结合先前对C型凝集素需求的发现,强调了ECM对调节多细胞玫瑰花结发育和防止动物近亲的假细胞粘附的重要性。

结果

玫瑰花结缺陷突变体通过混杂的细胞粘附形成无定形的细胞团。

原花环缺陷筛选由莱文等人。(2014)产生了9个突变体,分为7个临时表型类。在这项研究中,我们筛选了21925个额外的克隆,并鉴定了一个额外的7个突变体,这些突变体在食蚜蝇属RIFs。(对于本研究,我们用过食蚜蝇属膜外囊泡是RIF的来源,如上所述沃兹尼卡等,二千零一十六)。比较有或无RIF的16个总花环缺陷突变体的表型,我们可以将4个广泛的表型分类:(1)A类突变体,在没有RIF的情况下具有野生型形态,在有RIF的情况下完全没有花环,(2)在没有RIF的情况下具有野生型形态的B类突变体,并且在有RIF的情况下形成具有异常结构的花结减少水平,(3)C类突变体,在有或无RIF的情况下产生大的细胞团,而在有RIF的情况下形成很少或没有玫瑰花结,(4)主要以单体细胞形式存在的D类突变体,在没有RIF的情况下没有检测到细胞的线性链,在RIF的情况下也没有检测到玫瑰花结。(补充文件-表S1)。

在分离出的16个玫瑰花结缺陷突变体中,七个突变体属于C类。在这项研究中,我们重点研究了四种C类突变体-海泡石,肥皂泡沫,混乱,和蒸粗麦粉(以前叫分支莱文等人,二千零一十四)-形成无定形,密集的细胞团,无论有没有步枪,但永远不会发展成玫瑰花结(表1图1A,B)。我们发现这些团块中含有一些到数百个随机聚集的突变细胞,与野生型莲座丛不同的是,所有细胞的基极都朝向莲座丛中心,顶端的鞭毛从莲座丛表面延伸出来。(阿列加多等,二千零一十二莱文等人,二千零一十四沃兹尼卡等,二千零一十六)。此外,与野生型玫瑰花结的结构稳定性和抗剪性对比(图1A莱文等人,二千零一十四)C类突变体形成的细胞团对剪切敏感,在移液管或涡流培养时分离成单体细胞。(图1A)。

图1含4种补充剂 看到一切
突变细胞聚集并不能形成玫瑰花结。

)野生型细胞是单细胞或在没有玫瑰花结诱导因子(RIF)的情况下形成线性链,与RIF一起培养时形成有组织的球形玫瑰花结。玫瑰花结能抵抗剪切力,并能在旋涡中存活。四种C类突变体-海泡石,肥皂泡沫,库斯库斯以及在有或无RIF的情况下形成杂乱的细胞团。这些团块对旋涡没有抵抗力,并且会分裂成单个细胞。()C类突变体不形成任何可检测的玫瑰花结。在RIF存在下48小时后,以玫瑰花结中细胞的百分比测量玫瑰花结的发育,并以平均扫描电镜显示。未检出玫瑰花结。(C)C类突变体在旋涡破坏后迅速聚集成大团块。涡流后,野生型和突变型细胞在没有RIF的情况下培养30分钟,并通过自动图像分析定量凝块大小。数据显示为小提琴箱线图,显示中间单元格编号(水平线),四分位间距(白色框)和范围,不包括异常值(垂直线)。所有突变体的细胞质量都明显较大(K-S试验,****p<0.0001)比野生型细胞培养中发现的。(D)没有RIF的C类突变体旋涡后数分钟内发生团聚。揭示了团块是通过聚集而不是通过细胞分裂形成的。在0时获得的驾驶员信息中心图像,15,涡流后30分钟。比例尺=20μm。

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表1
野生型和C类突变体的表型
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应变 %玫瑰花结中的细胞 细胞相互作用 成功的抗议?
野生型 八十七点七 不结块 是的
海船 丛生
肥皂水 丛生
库斯库斯 丛生 是的
混乱 丛生 是的

在受到剪切后,我们观察到突变细胞在几分钟内重新聚集成新的团块,而野生型细胞从未形成团块(图1C,D;罕见的细胞加倍可能是由于最近的细胞分裂)。剪切力破坏后30分钟内,细胞团大到75,55,32,23个细胞以蒸粗麦粉形式形成,肥皂泡沫,海船,以及复杂的突变培养物,分别。此外,用细胞周期抑制剂aphidicolin阻断细胞分裂并不能阻止凝块的形成。(图1-图补充件1)。两种类型的重组速度(小于单细胞分裂所需的~6小时)(莱文等人,二千零一十四图1-图补充2)在没有细胞分裂的情况下观察细胞聚集(图1-图补充件1)证明单细胞聚集就足以形成团块。的确,每一个被测试的突变体也显示出细胞增殖的轻微缺陷(图1-图补充2)。

因此,细胞丛不是异常的玫瑰花结,它从不通过聚集形成,而是需要至少15-24小时通过连续的细胞分裂循环进行无性发育。(Dayel等人,二千零一十一Fairclough等人,二千零一十)。尽管如此,我们测试了裂缝的存在和不存在是否会影响杂乱和粗粉团块的形成。在有或没有裂谷的情况下形成的团块在大小上具有可比性(K-S试验;图1-图补充3)。细胞聚集不是菌株特异性的,未标记的杂合子和表兄弟突变体细胞粘附在野生型细胞上,通过细胞质mwasabi的表达来鉴定。(图1-图补充4)。

在这个筛选中分离出的7个聚集/聚集的C类突变体在莲座丛发育中也有缺陷,这表明混杂细胞粘附和莲座丛发育失败之间存在直接联系。

改进基因定位S.罗塞塔通过体段分析

接下来,我们开始鉴定每一个突变体的丛生和玫瑰花结缺陷表型的致病突变。在…莱文等人。(2014)研究,无玫瑰突变体与表型野生型定位株杂交(以前称为分离株B)。莱文等人,二千零一十四)根据单倍体f1s的基因分型,在60个pcr上验证了无花突变株和定位株之间的不同基因标记。(莱文等人,二千零一十四)。60个标记在55MB基因组中分布不均,证明不足以为本研究绘制C类突变体。使问题复杂化,序列多态性水平低S.罗塞塔基因组装配草图中的实验室菌株和重复序列丰度(Fairclough等人,二千零一十三莱文等人,二千零一十四)使得识别和验证额外的遗传标记变得困难,然而,在个体标记上进行基因分型证明是劳动密集型和昂贵型。

为了克服这些障碍,我们修改了在其他系统中开发的块体分离方法。(Doitisidou等人,二千零一十Leshchiner等人,二千零一十二李斯特等人,二千零九Pomrang等人,二千零一十一Schneeberger等人,二千零九Voz等人,二千零一十二温格等人,二千零一十)用于S.罗塞塔。我们的策略包括:(1)将突变体交叉到绘图菌株(包含先前确定的序列变体);(2)在超级包1上的微卫星上通过基因分型分离出杂合二倍体;(三)诱导减数分裂;(4)单倍体F1后代的克隆培养;(5)F1后代表型;(6)根据群体表型汇集F1后代;(7)对F1突变体的基因组DNA进行深度测序,以发现与聚集表型分离的突变。(图2-图补充件1)。

测试批量Segregant方法是否适用于S.罗塞塔,首先,我们分析了先前绘制的无花突变体和绘制的菌株之间的交叉点。(莱文等人,二千零一十四)。我们从一个无玫瑰杂交图谱菌株中分离出38个具有玫瑰状缺陷表型的f1s。(莱文等人,二千零一十四)从每个细胞中生长克隆培养物,汇集产生的文化,提取了他们的基因组DNA,并对汇集的突变基因组进行测序,平均覆盖率为187x。在没有与无花细胞表型分离的序列变异背景下,发现5个未连锁的单核苷酸变异(snvs)和插入/缺失(indel)与表型分离。(补充文件-表S2)。其中四个被检测到的序列变异可能与这些变异的相对较低的序列覆盖率(整个基因组的覆盖率>0.25倍)导致的表型存在假相关性。(补充文件-表S2)。相反,剩余的snv在基因组的一个组装良好的部分被检测到,在接近整个基因组平均覆盖的测序深度。分离SNV,在Supercondig 8的427804位置,与莱文等人。(2014)补充文件-表S2)。因此,一种基于汇集F1单倍体突变体的方法,识别与表型分离的序列变异,用总基因组的>0.25倍的覆盖率来掩盖那些被检测到的snvs/indel,对于正确定位无花紫罗兰引起的突变是有效的。(图2-图补充件1)。因此,我们使用这一验证的批量segregant方法来映射聚集突变体。

对本研究中所描述的四个丛生/玫瑰状缺陷突变体进行了定位杂交(Seafoam,2002)。肥皂泡沫,混乱,和couscous)以及所有四个杂交都产生了杂合子二倍体,证明他们有能力交配。正如先前的研究所观察到的S.罗塞塔交配(交配)莱文等人,二千零一十四沃兹尼卡等,二千零一十七)二倍体细胞每一个都分泌一个称为膜盒的烧瓶状附着结构,并且是单细胞的。因此,杂合子二倍体不能说明突变是显性还是隐性,因为表型只能在单倍体细胞中检测到。对于海泡石和肥皂水,我们分离出杂合子二倍体,但从未恢复具有突变表型的F1后代。(表1)。海泡石映射株和肥皂泡映射株杂交中无法恢复具有丛生或莲座丛缺陷表型的单倍体可以用以下任何一种解释:(1)丛生/莲座丛缺陷表型是多基因的,(2)减数分裂缺陷与致病突变有关。和/或(3)突变体适应性缺陷使野生型后代比突变体后代更具竞争力。相反,杂合子二倍体从杂合子和表兄弟杂交到定位株产生了野生型和突变型表型的F1单倍体后代,从而成功定位了致病基因损伤。详情如下。

一个假定的糖基转移酶的杂映射

按照批量Segregant方法,我们在杂波中鉴定了5个序列变异,它们与丛生和玫瑰花结缺陷分离。其中只有一个——在Supercondig 1的1919681位置——的测序覆盖率至少是基因组其余部分平均序列覆盖率的0.25倍。(图2A补充文件-表S3)。在突变F1子代到定位株的回交中,我们证实了snv与玫瑰花结缺陷表型的紧密联系。(图2B)。此外,所有表现出玫瑰花结缺陷的F2子代也有聚集表型。考虑到两个性状与snv的紧密联系,以及没有任何可检测的相邻序列变异,我们推断,在基因组位置1:1919681处的单点突变导致了混杂突变体的丛生和玫瑰花结缺陷表型。

图2含4种补充剂 看到一切
Jumble映射到一个定位于高尔基体的预测糖基转移酶。

)Jumble具有预测的跨膜结构域(标记为TM)和二级结构(标记为黑色矩形的α螺旋)。结构同源性算法预测杂合子在结构上与特征良好的糖基转移酶相关。图2-图补充2b)。突变基因在核苷酸1109处有一个T到C突变,导致脯氨酸在氨基酸位置305处取代亮氨酸。()一个突变的F1子代回交到定位株,产生了9个玫瑰花结形成的F2分离株和野生T型等位基因,12个丛生的F2分离株和混乱LW1C等位基因。遗传显著偏离了未连锁性状的孟德尔遗传预期,证实了两者之间的紧密联系。混乱LW1等位基因和团块,无花型。X=卡方值,D.F.=自由度。(C、D)转基因表达混乱MTFPMTFP杂波挽救了复杂突变体中的玫瑰花结发育,但是混乱LW1-MTFPMTFP杂波LW1,或MTFP没有。输血后立即添加RIF,输血后24小时添加40μg/ml的Puromycin以选择转化剂。(C)以转染72小时后玫瑰花结细胞的百分比测量玫瑰花结的发育,并以平均值sd表示。未检出玫瑰花结。(n=从3个技术复制品中每一个计数200个细胞;两次生物复制)。(D)通过转基因补充的玫瑰花结混乱MTFP杂合突变体表现为表型野生型,玫瑰花结中的大多数细胞在细胞顶端基部有可检测的荧光表达。图示为代表性玫瑰花结。(E-H)为了检查本地化,混杂的姆瓦萨比或混杂的LW1-mwasabi(青色)在外语教学启动子与野生型细胞膜标志物mcherry(洋红)共表达。S.罗塞塔。杂色姆瓦萨比局限于细胞生长的顶端。(e)没有步枪或(G和RIFs一起,与高尔基体的定位一致。当表达于其他野生型细胞时(f)没有步枪或(H和RIFs一起,突变体混乱LW1-mwasabi错误地定位到ER和食物液泡。框表示高尔基体在细胞顶端的推测位置。食物液泡(星号)通常是由于摄取的细菌或通过在食物液泡中积累荧光标记而显现出来的。也许通过自噬。供参考,箭头表示鞭毛的底部,尽管在所示的焦点平面上鞭毛可能不可见。比例尺=5μm。

https://doi.org/10.7554/188bet体育电竞elife.41482.008

这一突变导致了一个后来被称为T到C的基因转变。混乱(genbank登录号egd72416/ncbi登录号xm_;图2A)。这个混乱该基因包含一个单外显子,并被预测编码一个包含一个跨膜结构域的467氨基酸蛋白质。遵循年制定的公约莱文等人。(2014),突变等位基因,在氨基酸位置305处,它被预测为一种亮氨酸取代脯氨酸,被称为混乱LW1.

我们使用最近开发的方法来表达S.罗塞塔布斯等人,二千零一十八)测试混乱带N-或C-端子单体Teal荧光蛋白MTFP)基因融合S.罗塞塔伸长系数L外语教学)启动子可以补充杂合突变体的突变和挽救玫瑰花结的发育。(图2C,D)。我们能够通过使用一个质粒来丰富罕见的转化细胞,其中puromycin抗性基因(派克靴)在同一启动子下表达。混乱融合基因两个编码序列由一个编码自剪切肽的序列分离。(基姆等人,二千零一十一)。野生型杂突变细胞的转染混乱MTFP随后进行嘌呤霉素筛选和RIF的添加,培养出9.33±5.07%的细胞在玫瑰花结中。(图2C)。同样地,杂波变换MTFP杂波随后进行了puromycin筛选和玫瑰花结诱导,结果培养出7.00±4.91%的玫瑰花结细胞(图2C)。重要的是,我们没有检测到任何玫瑰花结,当我们用MTFP单独地,混乱LW1-MTFP,或MTFP杂波LW1.野生型杂突变体的互补混乱等位基因,尽管是人口的一部分,进一步确认混乱LW1突变导致细胞聚集和玫瑰花结缺陷表型。输血实验不允许所有细胞发育成玫瑰花结的事实可能是由于许多原因,包括对未转化细胞的不完全选择,不同转化细胞中转基因表达水平的差异,以及mtfp标记降低或以其他方式改变杂蛋白活性的可能性。

接下来我们试图确定混乱基因。未经记录的爆炸搜索混乱其他九个鞭毛虫的同源体(图2-图补充2a)在真菌中(图2-图补充3)但动物没有。鞭毛虫同系物混乱在代表三个主要的鞭毛虫科的物种的转录子中检测到。(李希特等人,二千零一十八)暗示混乱在鞭毛虫起源和多样化之前进化的。尽管Interpro(芬兰等,二千零一十七和Pfam(芬兰等,二千零一十六)在杂波中没有发现任何已知的蛋白质结构域,NCBI保守域搜索(Marchler Bauer等人,二千零一十七)预测一个低置信度的糖基转移酶域(E值3.8703)。此外,两种不同的算法使用预测的二级和三级结构来识别潜在的同系物,HHphredZimmermann等人,二千零一十八和PyRe2(Kelley等人,二千零一十五)预测Jumble与注释良好的糖基转移酶有关(hhphred:e值7.519多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶4;phyre2:对人多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶2的置信度94.5%(图2-图补充2b)。混杂的LEU305Pro替代品LW1破坏预测的α螺旋,我们假设它会阻止杂蛋白的正确折叠。(图2A)。

糖基转移酶在动物发育中起着重要作用。(Sawaguchi等人,二千零一十七张艺谋,二千零八)和细胞粘附(Mü勒等人,一千九百七十九斯特佛德一千九百九十二)。它们的生化功能包括转移活性核苷酸糖,也被称为糖基供体,对脂类,蛋白质,或碳水化合物受体(莱尔森等人,二千零八)。动物中的靶受体包括关键信号和粘附蛋白,如整合素和钙粘蛋白,其活性受N-和O-键多糖修饰的调节,也被称为N-和O-连接的聚糖(拉森等人,二千零一十七赵等,二千零八)。尤其是,许多特征明确的糖基转移酶在高尔基体中起作用,它们使通过分泌系统运输的糖基化分子(埃尔巴塔利二千零六图和班菲尔德,二千零一十)。为了调查混乱的地方,我们将野生型细胞杂乱马斯巴比基因融合在S.罗塞塔外语教学发起人。巨量mwasabi蛋白,位于鞭毛基部附近的细胞体顶端。基于与透射电子显微图的比较S.罗塞塔以及其他鞭毛虫,Jumble Mwasabi定位与高尔基体的位置相对应,其中还没有荧光标记S.罗塞塔图2E,G图2-图补充4a利德比特二千零一十五)。相反,混乱LW1马斯巴比,在整个细胞内呈管状分布,并与内质网(ER)标记共同定位。(图2F,h图2-图补充4b布斯等人,二千零一十八)。杂波的ER定位LW1这与错义突变破坏正常蛋白质折叠的假设是一致的,因为经常错误折叠的蛋白质被保留在内质网中并以降解为目标。(Kopito一千九百九十七)。混乱的故障LW1蛋白质正确定位在高尔基体强烈提示功能丧失。

表兄弟映射到预测甘露糖基转移酶的损伤处

我们采用类似的策略来绘制库斯库斯突变表型下的遗传损伤。利用体分格法对一个couscous_×作图菌株杂交的F1突变体后代进行了研究。我们鉴定了8个序列变异,它们与丛生和玫瑰花结缺陷表型分离。其中只有一个——在supercontig 22的462534位置处的单核苷酸缺失——其测序覆盖率至少为其余基因组平均序列覆盖率的0.25倍。(图3A补充文件-表S4)。通过对F1突变体回交至定位株的F2突变体进行基因分型,进一步证实了缺失与丛生和玫瑰花结缺陷表型的紧密联系。(图3B)。考虑到紧密的联系,我们推断,在超级凝固酶22上462534位的缺失既会导致丛生,也会破坏表兄弟突变体细胞的玫瑰花结发育。

couscous映射到一个具有泛/苹果结构域的预测甘露糖基转移酶。

)couscous有一个预测的信号序列,一个pan/apple域(pan),甘露糖基转移酶结构域。导致损伤的是在核苷酸位置2447处的1-碱基对缺失,导致氨基酸728处的移码。导致75个氨基酸在野生型和突变型(cous)序列之间不一致,在氨基酸803处有一个早期停止密码子。()将两个突变F1子代独立回交至定位株,获得38株具有野生型GCCC等位基因的玫瑰花结形成F2菌株和51株具有野生型GCCC等位基因的丛生F2菌株。库斯库斯LW1GCC等位基因遗传显著偏离了未连锁性状的孟德尔遗传预期,证实了两者之间的紧密联系。库斯库斯LW1等位基因和团块,无花型。X=卡方值,D.F.=自由度。(CD)库斯库斯突变细胞中玫瑰花结的形成可以通过转基因表达来挽救。库斯科MTFPMTFP蒸粗麦粉,但不是库斯库斯LW1-MTFPMTFP蒸粗麦粉LW1,或MTFP独自一人。输血后立即加入RIF,输血后24小时加入40μg/ml嘌呤霉素,选择阳性转化物。(C)用RIF处理后72小时测定玫瑰花结发育率(平均±sd)。未检出玫瑰花结。(n=从3个技术复制品中每一个计数200个细胞;两次生物复制)。(D)通过转基因补充的玫瑰花结库斯科MTFP在蒸粗麦粉中,突变体表现为野生型。图示为代表性玫瑰花结。比例尺=5μm。

https://doi.org/10.7554/188bet体育电竞elife.41482.013

supercontig 22上462534位的单核苷酸缺失位于一个四外显子基因中。以下简称库斯库斯(genbank登录号egd77026/ncbi登录号xm_)。突变导致预测的移码,导致突变蛋白的早期终止密码子。库斯库斯LW1图3A)。就像那些杂乱无章的突变体一样,我们能够通过将细胞与两种细胞中的任何一种进行转染来挽救部分人群中的玫瑰花结形成。库斯科MTFPMTFP蒸粗麦粉基因融合外语教学启动子(图3C,D)从而增强对映射结果的信心。

预测的couscous氨基酸序列包含一个特定类型的糖基转移酶结构域,α-甘露糖基转移酶结构域,将活性甘露糖转移到核心N-连接多糖和O-连接甘露糖的外链上。(Strahl Bossinger等人,一千九百九十九)。预测的甘露糖基转移酶结构域与α1-2甘露糖基转移酶(mnn2)蛋白具有28%和35%的氨基酸序列同源性。酿酒酵母白色念珠菌,分别包括在许多糖基转移酶家族中发现的保守的dxd基序。(威金斯和蒙罗,一千九百九十八图3-图补充1a)。mnn2蛋白催化细胞壁蛋白上含有低聚糖的甘露糖的第一个分支的添加。(雷纳和蒙罗,一千九百九十八)并且絮凝需要适当的Mnn2活性,或非交配聚集,在里面S.酿酒酵母斯特佛德一千九百九十二)。除了甘露糖基转移酶结构域外,蒸粗麦粉被预测有一个由三个二硫化物桥的保守核心组成的泛/苹果结构域。(何等,一千九百九十八Tordi等人,一千九百九十九)。泛/苹果结构域在真核生物中广泛分布,包括动物,它们介导蛋白质-蛋白质和蛋白质-碳水化合物的相互作用,通常在细胞外表面(何等,一千九百九十八Tordi等人,一千九百九十九)。

在野生型细胞中,粗麦粉转基因外语教学发起人,在散布在胞质溶胶中的粉刺中发现了蒸粗麦粉,衣领和细胞膜(图3-图补充1b,c)。虽然库斯库斯姆瓦萨比显然不属于高尔基人,Puncta可以与ER共同定位,其中糖基转移酶也已知起作用。(埃尔巴塔利二千零六图和班菲尔德,二千零一十)。然而,尽管尝试将细胞与粗麦粉以及ER标记(Mcherry与C端HDEL ER保留信号序列融合)(布斯等人,二千零一十八)我们无法检测到任何表达两种基因融合的细胞。此外,蒸粗麦粉与荧光蛋白的融合或其过度表达可能干扰其在S.罗塞塔。因此,我们目前还不确定couscous蛋白的亚细胞定位。

杂和粗麦粉突变体在基极缺乏适当的糖修饰。

因为Jumble和Couscous在预测的糖基转移酶中都有突变,我们假设细胞表面糖的丰富或分布,叫做聚糖,在杂和粗麦粉上,突变细胞可能发生改变。为了研究细胞表面多糖的分布,我们被玷污了S.罗塞塔含多种荧光标记的糖结合凝集素。在测试的22种凝集素中,21或者不认识S.罗塞塔或者在野生型中有相同的染色模式,杂碎和粗麦粉细胞(补充文件-表S5)。

剩下的凝集素,杰卡林与野生型细胞的顶端和基极结合(图4A,B,B′)。Jacalin还以类似于无花C型凝集素的模式将充满玫瑰花结中心的ECM染色得很亮。(莱文等人,二千零一十四图4A,B′)尽管这两种抗体不能同时成像,因为Jacalin在细胞固定后不结合,而且标记的无花抗体在活细胞的食物液泡中积累强烈。与野生型细胞相比,粗表突变体和混杂突变体中,Jacalin染色的基片缺失或明显减少。在有无步枪的情况下(图4C-F)。有趣的是,突变细胞中的花青素染色的顶端斑点与野生型细胞相似。这可能解释了野生型和突变体全细胞裂解液中用西林印迹法检测到的条带缺乏明显差异。(图4-图补充件1)。混合细胞的转化MTFP杂波不仅挽救了玫瑰花结的发展(图2C,D)还恢复了野生型糖基化模式,从互补玫瑰花结中心的Jacalin染色可以看出(图4-图补充2)。对于蒸粗麦粉细胞也是如此,在其中转换库斯科MTFP挽救了玫瑰发育和野生型糖基化模式(图3C,D图4-图补充2)。因此,杂合子和粗麦粉突变体细胞的糖基化缺陷与基因损伤直接相关。混乱库斯库斯分别。

图4含3种补充剂 看到一切
杂合子和粗麦粉突变体中基础糖基化模式的破坏。

fitc标记的jacalin结合野生型单细胞的顶端和底端。()在玫瑰花结中心的细胞外基质中富集。(AB'装箱区域来自)。尽管fitc-jacalin染色在杂波的顶端极表现正常。(C)还有蒸粗麦粉(D)突变细胞,fitc-jacalin染色在细胞的基极上是不可检测的。CD)或存在(+rifs;C’D’)RIFS。箭头表示顶端,箭头表示底端。(e)这幅漫画描述了如何测量Jacalin荧光。从fitc-jacalin染色细胞的显微照片开始,从细胞体周围的衣领边缘到衣领的另一边缘画一条线,根据细胞大小和背景强度对荧光信号进行归一化处理。(f)根据细胞体的标准化长度(n=2个生物复制品)绘制至少59个细胞中每种情况下测得的Jacalin的平均标准化荧光强度。与野生型相比,杂合子和蒸粗麦粉-/+RIF降低了根杆处的苦苷结合。灰色阴影表示95%的置信区间。比例尺=5μm。

https://doi.org/10.7554/188bet体育电竞elife.41482.015

杂合子和粗麦粉突变体的基础Jacalin染色缺失表明混乱LW1库斯库斯LW1要么破坏糖修饰分子向细胞基极的适当运输,要么改变糖基化事件本身。因此,我们检测了突变株中无玫瑰蛋白的基础分泌是否被破坏。在杂音和表音细胞中,无花蛋白质正确定位于基极,但它的表达并没有增加,也没有在用rifs治疗后分泌出来。通常出现在野生型细胞中。(图4-图补充3)。因为玫瑰花结的发育需要无花,这种不能正确地上调和分泌无花细胞可能导致混乱和表兄弟细胞的玫瑰花结缺陷表型。

讨论

在分离出的16个玫瑰花结缺陷突变体中,莱文等人。(2014)在这项研究中,几乎一半(7)也表现出轻微到严重的聚集表型。这表明,防止野生型细胞间杂乱粘附的机制很容易被破坏。我们发现,突变细胞与其他突变型或野生型细胞的混合粘附导致了聚集表型,而不是不完全的细胞因子分裂。最近的一项研究显示这种细菌费氏弧菌诱导S.罗塞塔为了形成蜂群的细胞,视觉上类似于突变体丛,作为它们交配行为的一部分(沃兹尼卡等,二千零一十七)。然而,C类成簇突变体似乎不太可能与聚集有关;二倍体细胞的融合和随后的沉降v.诉菲舍利未在培养的C类突变体中观察到诱导交配。v.诉费舍里.

无论是大杂烩还是蒸粗麦粉,导致突变的基因与预测的糖基转移酶基因相对应。与其作为糖基转移酶的作用一致,集中在高尔基体上的杂波,但蒸粗麦粉似乎在胞质点状体和细胞膜中定位。我们预测预测糖基转移酶的突变是功能缺失等位基因。考虑到突变体的转染S.罗塞塔野生型等位基因足以补充每一个突变。虽然我们没有发现预测糖转移酶的靶点或两种表型间相互作用的确切性质,杂合子和表兄弟突变体细胞基极糖萼的破坏(图4)提示细胞外基质的调节对防止结块和促进玫瑰花结的发育具有一定的作用。

聚集表型的一个可能解释是混乱库斯库斯需要调节细胞表面粘附分子和受体的活性。糖基化调节动物体内两种关键粘附蛋白的活性:调节ECM粘附的整合素,还有钙粘蛋白,在它们在细胞信号传导和动物发育中的各种作用中,结合其他钙粘蛋白形成细胞粘附,称为粘附连接。(拉森等人,二千零一十七赵等,二千零八)。钙黏蛋白的活性可以通过糖基转移酶进行正调节或负调节。例如,上皮钙粘蛋白(E-钙粘蛋白)被N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III(GNT III)修饰,其活性导致细胞粘附增加,而N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(GNT-V)的活性导致细胞粘附降低。(Carvalho等人,二千零一十六Granovsky等人,二千)。Gnt-V基因敲除增强E-钙粘蛋白及相关N-钙粘蛋白介导的细胞粘附(Carvalho等人,二千零一十六郭等,二千零九)。E-钙粘蛋白失活,包括通过GNT-V或GNT III的过表达或欠表达,被认为是上皮癌的标志(Hirohashi和Kanai,二千零三)。S.罗塞塔表达29种不同的钙粘蛋白(尼克尔斯等人,二千零一十二)而且有可能突变到混乱库斯库斯破坏细胞粘附分子(如钙粘蛋白)的调节性糖基化。

另一种可能性是混乱库斯库斯在细胞表面添加一个保护糖层,糖基转移酶活性的丧失显示了下面的粘性表面。如果混乱库斯库斯将分支添加到现有的糖修改中,它们的功能丧失可能在细胞表面暴露出新的糖部分,作为凝集素聚集细胞的配体。凝集素介导不同生物体的细胞聚集(Colin Hughes一千九百九十二)。例如,海绵,如苏铁土工大学,可以分解成单个细胞,然后通过翻译后糖修饰的凝集素结合重新聚集。(Mü勒等人,一千九百七十九)。在S.酿酒酵母,甘露糖基转移酶mnn2在凝集素聚集识别的细胞壁上添加甘露糖结构,需要mnn2进行适当的絮凝。(雷纳和蒙罗,一千九百九十八斯特佛德一千九百九十二)。在细胞表面杂乱无章地暴露新的糖会导致假聚集。可能通过凝集素或其他糖结合蛋白。

更难推断单细胞中增加的团聚是如何干扰莲座丛发育的。一种可能是,我们假设的ECM糖基化的破坏可能促进结块,也可能阻止玫瑰花结发育所需的ECM的适当成熟。(图5)。先前的研究表明S.罗塞塔凝集素小麦胚芽凝集素(WGA)识别的细胞有能力形成玫瑰花结。这表明糖基化可能是玫瑰花结发育的必要条件。(Dayel等人,二千零一十一)。而wga染色似乎没有混乱和表兄弟干扰。(补充文件-表S5)与野生型相比,在基极的Jacalin染色严重减少或消失。雅加林染色在野生型玫瑰花结中心丰富,图案类似于无花植物。玫瑰花结发育需要(莱文等人,二千零一十四)。有趣的是,乱七八糟的,Rosetteless定位到正确的极点,但并没有在玫瑰花结诱导下变得丰富,表明ECM未正确成熟。Rosetteless有粘蛋白样的ser/thr重复序列,是重糖基化的预测位点和两个C型凝集素域,预期结合糖部分。(莱文等人,二千零一十四)。因此,迷迭香可能通过直接糖基化或通过杂合子和蒸粗粉对潜在结合伙伴的糖基化进行调节。

C类莲座丛缺陷突变体混生丛生模型。

野生型S.罗塞塔有一个糖基化的ECM基片(红色),以凝集素Jacalin为标志,在玫瑰花结形成过程中变得丰富。无玫瑰蛋白,是形成玫瑰花结所必需的,并推测在将玫瑰花结连接在一起时起到结构作用,定位于细胞基极上的同一位置,并变得与莲座丛形式相似丰富。突变体缺乏Jacalin染色的糖基化基片。细胞表面的改变可能导致结块,要么是通过细胞粘附分子的错误调节,要么是暴露在一个通常被掩盖的粘附细胞表面。同样的改变允许C类突变体聚集也阻止了玫瑰花结的形成,可能是通过破坏无玫瑰蛋白或其一个相互作用伙伴的聚糖修饰。

网址:https://doi.org/10.75188bet体育电竞54/elife.41482.019

丛生,玫瑰状缺陷突变体强调了细胞聚集和调控克隆发育程序之间的差异,如动物胚胎发生或长有鞭毛的莲座丛发育。重要的是,所有现存动物的多细胞性都是通过细胞分裂而不是细胞聚集而产生的。提示抑制细胞聚集有利于克隆发育是动物起源的先决条件。我们的研究结果提高了糖基化和ECM的调节抑制细胞聚集同时稳定动物干细胞系的专性克隆多细胞性的可能性。糖基化仍然是现代动物组织结构的重要调节因子。(张艺谋,二千零八)。有趣的是,癌症抑制被认为是确保多细胞动物组织完整性的重要手段。(AkTipIS等人,二千零一十五)糖基化的破坏通常与转移癌有关。(Pinho和赖斯二千零一十五)。了解阻止假聚集的分子机制S.罗塞塔可能为确保干动物细胞协同作用的机制提供新的见解,同时也揭示了现代动物的癌症易损性。

材料和方法

关键资源表
试剂类型
(种)或
资源
任命 源或
参考
标识符 附加的
信息
Gene沙门菌属
罗塞塔
混乱 genbank加入
EGD72416/NCBI加入
XM_;
GeneS.罗塞塔 库斯库斯 genbank加入
EGD77026/NCBI加入
XMY900490809
应变,拉紧
背景
S.罗塞塔
重量 PMID:24139741 ATCC PRO-390;
加入
编号SRX365844
应变,拉紧
背景
S.罗塞塔
映射应变 PMID:24139741 登记号srx365839
应变,拉紧
背景
S.罗塞塔
混乱 PMID:25299189 登记号
SRR78667
应变,拉紧
背景
S.罗塞塔
库斯库斯 PMID:25299189 登记号
SRR78667
以前
命名分支
应变,拉紧
背景
S.罗塞塔
海船 PMID:25299189 登记号SRR8263910
应变,拉紧
背景
S.罗塞塔
肥皂水 PMID:25299189 登记号SRR8263909
应变,应变背景(麻黄藻 麻黄藻 PMID:22368173 ATCC BAA223
应变,应变背景(太平洋棘球 太平洋棘球 PMID:16627637 帝斯曼19836
应变,应变背景(菲舍尔弧菌 菲舍尔弧菌ES114 PMID:15703294 ATCC 700601
抗体 抗迷迭香 PMID:25299189 (1:400)
重组DNA试剂 麦克赫里质膜标记 PMID:30281390 RRID:AdgEng10949
加基因ID NK624
重组DNA试剂 麦氏ER标记 PMID:30281390 RRID:加基因_
加基因ID NK644
重组DNA试剂 pefl5'-actin3':混乱的mwasabi 本文 加基因ID NK690 带5’的PUC19主干
S.罗塞塔延伸系数L(外语教学发起人,J乌姆布尔
马萨比,肌动蛋白的3’UTR;通过组装
吉普森组装
重组DNA试剂 pefl5'-actin3':混乱LW1马斯巴比 本文 加基因ID NK691 带5’的PUC19主干S.罗塞塔延伸系数L(外语教学发起人,J乌姆布尔LW1马萨比
肌动蛋白的3’UTR;通过组装
吉普森组装
重组体
DNA试剂
pefl5'-actin3':粗麦粉 本文 加基因ID NK692 带5’的PUC19主干
S.罗塞塔伸长
因子l外语教学发起人,
C恶臭的马萨比,和3
来自肌动蛋白的UTR;组装
吉布森大会
重组体
DNA试剂
PEFL5'-肌动蛋白3':PAC-P2A-MTFP 本文 加基因ID NK676 带5’的PUC19主干
S.罗塞塔延伸系数L
外语教学发起人,S.罗塞塔
密码子优化嘌呤霉素
抗性基因(PAC)MTFP
肌动蛋白的3’UTR;
组装
吉布森大会
重组体
DNA试剂
pefl5'-actin3':pac-p2a-jumble-mtfp 本文 加基因ID NK694 亲本载体:PEFL5’
肌动蛋白3“::PAC-P2A-MTFP
混乱
插入使用
吉普森组装
重组体
DNA试剂
pefl5'-actin3':pac-p2a-jumbleLW1-MTFP 本文 附加基因
身份证NK695
亲本载体:PEFL5’
肌动蛋白3“::PAC-P2A-MTFP
混乱LW1
插入使用
吉普森组装
重组体
DNA试剂
pefl5'-actin3':pac-p2A-mtfp-jumble 本文 加基因ID NK696 亲本载体:PEFL5’
肌动蛋白3“::PAC-P2A-MTFP混乱
使用吉布森组件插入
重组体
DNA试剂
pefl5'-actin3':pac-p2A-mtfp-jumbleLW1 本文 加基因ID NK697 亲本载体:PEFL5’
肌动蛋白3“::PAC-P2A-MTFP混乱LW1
使用吉布森组件插入
重组体
DNA试剂
pefl5'-actin3':pac-p2a-couscous-mtfp, 本文 加基因ID NK698 亲本载体:PEFL5’
肌动蛋白3“::PAC-P2A-MTFP库斯库斯
使用吉布森组件插入
重组体
DNA试剂
pefl5'-actin3':pac-p2a-couscousLW1-MTFP 本文 加基因ID NK699 亲本载体:PEFL5’
肌动蛋白3“::PAC-P2A-MTFP
库斯库斯LW1
插入使用
吉普森组装
重组体
DNA试剂
pefl5'-actin3':pac-p2A-mtfp-couscous 本文 加基因ID NK700 亲本载体:
pefl5'-肌动蛋白3':
PAC-2A型MTFP
库斯库斯插入的
使用吉布森组件
重组体
DNA试剂
pefl5'-actin3':pac-p2A-mtfp-couscousLW1 本文 加基因ID NK701 亲本载体:
pefl5'-肌动蛋白3':
PAC-2A型MTFP
库斯库斯LW1插入的
使用吉布森组件
其他 FITC标签为Jacalin 矢量实验室 RRID:ABA3636460
矢量实验室:
猫。FLK-4100号
(1:400)
其他 生物素化苦加林 矢量实验室 RRID:ABA23 36361
矢量实验室:CAT。
不。B-1155型
其他 链霉亲和素-Alexa Fluor 647共轭物 热的
费希尔科学公司
热渔夫
科学:猫。不。
三万二千三百五十七

媒体准备,菌株,和细胞培养

未富营养的人工海水(ASW)AK人工海水(AK)谷物草培养基(CG)如前所述制备高营养(HN)培养基。(布斯等人,二千零一十八莱文等人,二千零一十四莱文和金,二千零一十三)。野生型菌株,从中产生每个突变体,描述的菌株是SREPAC(ATCC pra-390;登记号srx365844),其中S.罗塞塔与被捕食的细菌进行单次共培养太平洋棘球(DSM 19836,莱文等人,二千零一十四莱文和金,二千零一十三Nedashkovskaya等人,二千零六)。海船,肥皂泡沫,而couscous(以前称为branched)是通过X射线诱变产生的,杂波是通过ems诱变产生的,如中所述。莱文等人。(2014).在莱文等人。(2014),分支/表兄弟没有完全的特征,并根据细胞分裂形成的团块导致异常的分支链菌落的假设来命名。(野生型链菌落主要是线性的,在这项研究中,我们对突变体进行了彻底的鉴定,发现这些团块是通过聚集而不是通过分支细胞分裂形成的。为了使突变名更好地反映表型,我们把它改名为couscous。对于常规培养,在5%(v/v)hn培养基中每2-3天稀释1:10的野生型和突变体培养物。映射应变,(以前称为隔离B莱文等人,二千零一十四)用于绘制交叉图(登记号SRX363839)是在诱导玫瑰花结的情况下种植的。a.马基蓬细菌(atcc baa-2233)。在ASW稀释的25%(v/v)CG培养基中,每隔2-3天传代1:10。用于输入S.罗塞塔,在AK中,细胞保持在5%(v/v)的hn培养基中。(布斯等人,二千零一十八)。最初用两种活体测定玫瑰花结形成。a.马基蓬a.马基蓬膜外囊泡(OMV)的制备沃兹尼卡等。(2016).对于每个测试应变,两种方法诱导的莲座丛中的细胞百分比相似地低/不存在,C类突变体的细胞丛在视觉上相似。(补充文件-表S1)。因此,除非另有说明,玫瑰花结诱导用a.马基蓬OMV,这里称为花环诱导因子(RIF)。

玫瑰花结表型的影像学和定量分析

对莲座丛表型进行成像(图1A)细胞以1×10的密度进行电镀。3毫升5%(v/v)hn培养基中的细胞/ml asw中,有或无食蚜蝇属RIFs。在8孔玻璃底培养皿(IBIDI 15μ-Slide 8孔猫科动物)中诱导玫瑰花结48小时后,对培养物进行成像。不。80826),涂上0.1 mg/ml聚D-赖氨酸(sigma)15分钟,用水清洗3次以去除多余的聚D-赖氨酸。用于在有或无RIF的情况下对野生型和突变型培养物进行成像。(图1A前两个面板)200μl的细胞用一个大口径移液管尖端进行电镀,使其破坏最小,并静置5分钟。对于旋涡细胞的图像(图1A底部面板)在电镀前,将200μl的细胞旋转15 s,并在电镀10分钟内成像,以防止再次聚集。采用Zeiss AXIO Observer.Z1/7宽视野显微镜、Hammatsu Orca Flash 4.0 LT CMOS数码相机和63X/NA1.40平面无色差油浸透镜(1.6X optivar设置)对细胞进行动态成像。

量化玫瑰花结诱导(图1B)细胞以1×10的密度进行电镀。3毫升5%(v/v)HN培养基中的细胞/ml ASW中的RIF。48小时后,将一小部分细胞用力旋转15 s,用甲醛固定。为了确定玫瑰花结中细胞的百分比,单细胞和玫瑰花结内细胞的相对数量用血细胞仪进行评分。玫瑰花结被计算为一组3个或3个以上的细胞,在暴露于旋涡后,相对于中心焦点具有有组织的极性。

细胞聚集的影像学和定量分析

使用修改后的方案对凝块进行定量分析。沃兹尼卡等。(2017)图1C图1-图补充3)。突变细胞在某种程度上,野生型细胞,会粘在玻璃上。因此,为了防止细胞仅仅粘附在8孔玻璃底盘的底部(Ibidi 15μ-Slide 8孔猫科动物)。不。80826)将培养皿涂上1%的BSA 1小时,用水冲洗3次,以去除任何残留的BSA。重要的是,在成像培养皿中添加BSA不会导致野生型细胞粘附在培养皿底部或彼此之间。细胞稀释至5×10细胞/ml,旋转15秒,分离任何预先形成的团块,并在BSA预处理过的盘子中进行电镀。对于量化,采用蔡司AXIO Observer.Z1/7宽视野显微镜、Hammatsu Orca Flash 4.0 LT CMOS数码相机和20倍物镜拍摄DIC图像。从整个油井的10个不同位置收集每个菌株的图像。

为了保持一致性,图像在ImageJ中被批量处理。为了准确分割相亮细胞和限制来自相暗细菌的信号,使用默认设置应用以下命令:“平滑”(减少背景细菌信号)。“查找边缘”(以突出显示明亮的choanoglagellate单元的相位)。“Despeckle”(去除噪音)“make binary”(转换为黑白),“Expande”(从分割扩展到平滑锯齿状边缘)“腐蚀”(恢复到膨胀前的尺寸)以及“填充孔”(用于填充任何剩余的小孔)。最后,使用“分析粒子”命令分析图像,以计算束的面积,并且仅计算大于20μm的粒子。我们一直在过滤任何残留的细菌信号。细胞当量/团块(图1C图1-图补充3,右Y轴)通过将团块的面积除以代表性单个细胞的面积(近似于平均野生型细胞的面积)来计算。数据显示为小提琴箱线图,显示中间单元格编号(水平线),四分位间距(白色框)和范围,不包括异常值(垂直线)。每种情况下,从两个生物复制品中至少测量630个凝块。

为了检查成束是否需要细胞分裂,我们用阿维菌素阻止细胞分裂。(图1-图补充件1)。旋涡野生型细胞,混乱,将蒸粗麦粉培养物计数稀释至1×10。AK中5%(v/v)hn介质中的细胞/ml。对于每个菌株,250μm杀扑灵,等量的DMSO控制,或者没有额外的控制添加到每个条件中。24小时后,采用蔡司AXIO Observer.Z1/7宽视野显微镜、Hammatsu Orca Flash 4.0 LT CMOS数码相机和40倍的物镜拍摄DIC图像。

执行交叉映射

为每个突变株(海泡石,肥皂泡沫,混乱,以及couscous)和mapping菌株(以前被描述为分离株b)被尝试使用之前显示的两种方法诱导交配。S.罗塞塔:营养限制11天,添加2.5-5%费氏弧菌(ATCC 700601)条件介质(莱文和金,二千零一十三沃兹尼卡等,二千零一十七)。两种方法均能有效地诱导所有试图杂交的后代交配;在这里,我们报告了哪种方法用于为每个交叉点生成数据。通过限制稀释分离二倍体克隆,对诱导交配的细胞进行电镀。克隆分离株可以生长5-7天,并筛选出鞘细胞群。因为这是唯一记录的二倍体细胞类型(莱文等人,二千零一十四沃兹尼卡等,二千零一十七)。从每个细胞群中,我们从75μl细胞中提取DNA,从板上刮取细胞。收集和造粒细胞,在10μl碱性溶液(25 mM NaOH,2毫米乙二胺四乙酸,将样品转移到PCR板中,在100°C下沸腾20分钟,然后在4°C下冷却5分钟,然后加入10μl Tris溶液(40 mM Tris HCl,pH 7.5)。我们用2μl的样本作为每个基因分型反应的DNA模板。我们通过在Supercondig 1(正向引物:gacaggcaaacagacaga和反向引物:ccatccachgttcattcct)的577135位置的单个微卫星基因分型标记上的pcr进行基因分型来鉴定杂合子菌株,该标记区分了映射菌株(199 bp)中25 bp的缺失和用于产生突变体的菌株(217 bp)。含有两种大小的PCR产物的菌株被推断为二倍体。在CG培养基中,每天快速传代诱导减数分裂。

对于海泡石和肥皂水,我们能够通过与基于超级标记1上的基因分型标记的映射菌株交叉产生假定的异交二倍体。但是我们只能用莲座丛克隆分离出F1单倍体的种群,而不能分离出任何丛状的F1单倍体。无花型。海泡石和肥皂水的全基因组重排序显示在玫瑰花结混乱,库斯库斯位置。海泡石和肥皂水有17和34个预测的无义或错义突变,分别在编码序列和基因组非编码部分的额外突变中。海泡石和肥皂水的损伤,在编码预测糖基转移酶的基因中没有检测到。凝集素,或相关基因家族。如果不能绘制交叉点,不能从海泡石或肥皂水中鉴别出致病突变。

为了成功地将杂波交叉到绘图应变上,我们用Levin和King(2013年).第一,我们从快速增长开始,经常通过的菌株,造粒2×10每个菌株的细胞/ml一起重新悬浮在缺乏任何添加营养的10 ml ASW中。在美国西南部度过了11天的饥饿之后,我们将所有细胞(可能包括交配产生的二倍体细胞)制成颗粒,再悬浮在100%CG培养基中,以恢复任何二倍体。恢复3天后,我们通过限制ASW中10%(v/v)cg培养基的稀释来分离克隆。在这一步骤中,克隆分离的概率为0.91–0.93(使用泊松分布和每个平板的无鞭毛虫井数计算);莱文和金,二千零一十三)。三个克隆分离的杂合子群体,每一个细胞几乎只含有鞘细胞,如前所述,在超级1号微卫星上通过PCR进行基因分型鉴定。诱导减数分裂,杂合子在25%(v/v)CG培养基中每1-2天在ASW中稀释1:2,持续8天。一旦观察到玫瑰花结和游动细胞,我们重复序列稀释以分离克隆(克隆分离的概率为0.85–0.98)。我们收集了任何形成莲座丛或丛生的克隆分离的群体,并忽略了含有鞘细胞的任何孔,假设这些孔代表没有经历减数分裂的二倍体细胞。56%的非鞘层分离株显示细胞聚集表型,44%的非鞘层分离株能够形成玫瑰花结。与单个位点的孟德尔分离相一致(χ=1.162,df*=1,磷=0.28)。在超级标记1上用标记对分离株进行基因分型,以确保基因型和表型的独立分类确实发生。总而言之,收集30个团块F1S进行体分离分析。

对于成功的蒸粗麦粉十字架,我们诱导交配使用v.诉费希尔条件介质使用沃兹尼卡等。(2017).1×10的混合物在固定生长条件下,将粗麦粉和标测菌株细胞制成颗粒,再悬浮于5%(v/v)中。v.诉费舍里ASW中的条件介质。24小时后,细胞被造粒,在ASW的5%(v/v)hn介质中重新悬浮,恢复24小时。然后我们通过限制ASW中10%(v/v)cg培养基的稀释度来分离克隆。这一步克隆分离的概率在0.97-0.98之间。我们提取了如上所述的DNA,并通过在超级标记1上的一个微卫星基因分型标记上的PCR进行基因分型来鉴定杂合子克隆。四个克隆分离的杂合子群体,几乎只含鞘细胞,已识别。诱导减数分裂,杂合子在25%(v/v)CG培养基中每1-2天传代1:2,传代8天。一旦观察到玫瑰花结和游动细胞,我们重复克隆分离(克隆分离的概率为0.78–0.97)。我们收集了任何形成莲座丛或丛生的克隆分离的群体,并忽略了含有鞘细胞的任何孔,假设这些孔代表没有经历减数分裂的二倍体细胞。只有14.6%的非鞘层分离株是丛生的;与孟德尔比的偏差(χ=225.63,df*=1,磷<五点三四51)可能表明突变表型的潜在适应性缺陷。对分离株进行基因分型,标记在Supercondig 1上,以确保独立的分类确实发生。总而言之,收集22个团块f1进行体细胞分离分析。

全基因组测序

混乱,库斯库斯海船,并对肥皂水进行全基因组测序,以确定每个菌株中携带的突变。要做到这一点,混乱,库斯库斯海船,在ASW中,用500ml 5%(v/v)hn培养基将肥皂水细胞培养成固定相。为了产生聚集的基因组DNA进行批量分离分析,我们长大了5×10无花×定位株杂交的38个无花表型的F1S细胞(莱文等人,二千零一十四)5×10从杂××标测菌株杂交得到的具有丛状表型的30个f1s中的每一个的细胞,5×10库斯库斯作图菌株杂交的22个具有丛生表型的F1S中的每一个的细胞。对于每一个十字架,F1细胞被造粒,冰冻的,在DNA提取的裂解过程中结合。对于所有样品,我们进行了酚-氯仿DNA提取,并用CSCL梯度分离。S.罗塞塔来自污染的DNAE.太平洋航空公司气相色谱法测定DNA(国王等人,二千零八)。

多路复用,准备了100个bp配对的端库,并在Hiseq 2000光源上对其进行排序。库斯库斯海船,和肥皂水突变的DNA。多路复用,制备150 bp配对端库,并在Hiseq 2500光源上对无花_×标测菌株交叉和杂X标测菌株交叉汇集的DNA进行测序。对于couscous_×绘图菌株交叉DNA,多路复用,在miseq光源上制备300 bp配对端库,并对其进行测序。原始读取可在具有生物项目标识符prjna490902的NCBI短读取存档中获得。生物样品和SRA加入量如下:杂突变体SAMN10061445和SRR7866767,couscous突变体-samn10061446和srr7866768,海泡石突变体-SAMN1051893和SRR8263910,肥皂水突变体-SAMN1051894和SRR8263909,Rosetteless_×测绘应变Cross-SAMN10061447和SRR7866769,Jumble_×测绘应变Cross-SAMN10061448和SRR7866770,以及couscous_×测绘应变交叉-SAMN10061449和SRR7866771。用trimmomaticpe修剪原始读数(博格等人,二千零一十四)删除低质量的基本呼叫。修剪的读取被映射到S.罗塞塔参考基因组(Fairclough等人,二千零一十三)使用Burrows Wheeler校准器(李和杜斌二千零九)我们用picard去除了pcr的重复。(http://broadistitute.github.io/picard/)。我们重新调整了使用gatk的Indel调用周围的读取。(Depristo等人,二千零一十一)使用samtools和bcftools调用变量(李等,二千零九)。

批量序列分析

基因组中没有大的区域(即单倍型阻滞)被发现与任何杂交中的突变表型共分离。可能是因为稀少,遗传标记分布不均和/或重组率高。使用VCF工具VCF ISEC从汇集样本中筛选出序列变体。(丹尼克等人,二千零一十一):(1)为了只保留与亲本突变株共享的集合样本中的任何序列变体,因为集合样本和亲本突变株中都应存在任何因果突变,以及(2)去除与标测菌株(分离株B)共享的汇集样本中的任何序列变体,野生型(以前分离出C型)或无花突变(c2e5)的未突变对照,因为这些序列变异中的任何一个都不应导致玫瑰花结缺陷(莱文等人,二千零一十四莱文和金,二千零一十三)。其余的变异被质量过滤:深度>2,质量得分>10,而参考等位基因不是N。剩下的列表代表了集合群体中的高质量变种,这些变种与变种共享,排除了三种能够形成玫瑰花结的不同菌株。通过将映射到替代等位基因的读取次数除以samtools和bcftools确定的高质量读取总数来确定分离变体。(李等,二千零九;任何与替代等位基因对应的>99%读码的变体都被认为是与突变表型分离的变体。

回交

为了检验块状表型与块状分离分析预测的致病突变之间的联系,将杂×标测株和蒸粗×标测株中表现为块状表型的F1S回交到标测株上。对于混乱的F1后交叉,1×10从一株克隆分离的F1中生长的细胞,具有混杂的×定位株和1×10的丛生表型。将标测菌株细胞混合,丸化,再悬浮在10毫升5%(v/v)的溶液中。v.诉费舍里ASW中的条件介质。24小时后,这个v.诉费舍里用25%(v/v)cg培养基替换ASW中的条件培养基,并对细胞进行电镀以限制稀释。如前所述,通过超标记1上微卫星的PCR对克隆分离的鞘细胞群体进行基因分型,并鉴定出4个杂合子二倍体群体(克隆分离的概率为0.79–0.95)。杂合子快速传代2周诱导减数分裂,然后进行克隆分离(克隆分离的概率为0.95-0.98)。12个具有丛状表型的F2s和9个具有玫瑰花结表型的F2s被鉴定出来。(图2B)。采用上述碱基Tris法提取其DNA,并扩增引起突变的区域。用bfai消化所得的pcr产物4小时,分裂突变等位基因而不是野生型等位基因,用琼脂糖凝胶电泳对产物进行鉴定。

对于两个couscous f1回交,2.5×10couscous__x_映射菌株杂交和2.5×10两个具有丛生表型的f1s中的任何一个的细胞将标测菌株细胞混合,丸化,在0.5毫升2.5%(v/v)中再悬浮v.诉费舍里ASW中的条件介质。24小时后,v.诉费舍里用25%(v/v)cg培养基替代ASW中的条件培养基,将细胞培养至限制稀释(克隆分离的概率为0.85–0.97)。克隆分离的thecate群体通过在超级包体1上的微卫星的PCR进行基因分型,如上文所述,在每个杂交中识别出三个杂合子二倍体(总共6个)。将分离株快速传代2周诱导减数分裂,然后进行克隆分离(克隆分离的概率为0.88-0.97)。共鉴定出51个具有丛生表型的F2s和38个具有玫瑰花结表型的F2s。(图3B;采用上述碱基Tris法提取其DNA,导致突变的区域被放大,并对所得的PCR产物进行了桑格测序。

杂波和粗声域及结构预测和对准

蛋白质结构域编码混乱图2A库斯库斯图3A)使用interpro预测(芬兰等,二千零一十七)PFAM芬兰等,二千零一十六)以及NCBI保守域搜索(Marchler Bauer等人,二千零一十七)。用phyre2对杂波进行结构同源性分析。(Kelley等人,二千零一十五和HHphred(Zimmermann等人,二千零一十八)。人N-乙酰半乳糖胺基转移酶4(glcnac t4)催化结构域(hhphred:e值7.5)19)与hhphred使用pymol分子图形系统生成的预测杂波结构一致,版本2.0 Schr_dinger,有限责任公司图2-图补充2b)。其他鞭毛虫同系物混乱通过对20个已测序的choanoglagate转录子的反向爆破来确定。(李希特等人,二千零一十八)用clustalx进行校准。(Larkin等人,二千零七图2-图补充2a)。四种真菌同系物[复杂赛氏菌(NCBI加入xp_.1)半接触性达卡菌(NCBI加入EPS43829.1)脑炎奈玛氏菌(NCBI加入或2834.1)和白松露菌(NCBI加入PWW71609.1))通过使用S.罗塞塔杂蛋白序列并与clustalx排列(Larkin等人,二千零七图2-图补充3)用clustalx对酵母mnn2糖基转移酶域进行了同源性分析。(Larkin等人,二千零七图3-图补充1a)。

生成转基因结构

Jumble(genbank entrance egd72416/ncbi entrance xm_)和couscous(genbank entrance egd77026/ncbi entrance xm_)是从野生型cDNA中克隆的,如中所述制备。布斯等。(2018).混乱LW1从复杂突变株制备的cDNA中克隆。库斯库斯LW1不能直接从cDNA中克隆(可能是由于无义介导衰变导致的低mRNa水平,或仅仅是因为基因的高GC含量)。然而,中的1bp删除库斯库斯LW1经桑格基因组库斯库斯DNA测序证实。利用野生型基因的定点突变产生突变等位基因。

用于补充(图2c、d和3C、D)构建物是由一个pUC19骨架的质粒和一个5'S.罗塞塔延伸系数L(外语教学启动子,单体Teal荧光蛋白(MTFP),肌动蛋白的3’UTR(加基因ID NK633)(布斯等人,二千零一十八)。合成了一个puromycin抗性基因作为基因座,并对其密码子进行了优化。S.罗塞塔.嘌呤霉素抗性基因(派克靴)插入到外语教学启动子,通过自切猪病毒(p2A)的2a肽与荧光报告子分离。(基姆等人,二千零一十一)。复印件混乱,混乱LW1,库斯库斯库斯库斯LW1插入5'或3'的mtfp,并通过Gibson克隆通过一个灵活的连接序列(sggsgs)与mtfp分离。

用于荧光定位(图2E-H图2-图补充4b图3-图补充1b,c)构建物是由一个5’的puc19主干生成的。S.罗塞塔延伸系数L(外语教学发起人,马萨比以及肌动蛋白的3’UTR。复印件混乱(添加基因ID NK690),混乱LW1(加基因ID NK691)和库斯库斯(addegene id nk692)通过吉布森克隆插入由柔性连接序列(sggsgs)分离的5'mwasabi。质膜和ER标记来自布斯等。(2018)如前所述使用(addgene id NK624和NK644)。

S.罗塞塔转染和转基因表达

如中所述,遵循输血方案。布斯等。(2018)http://www.protocols.io/groups/king-lab)。输血前两天,培养瓶(康宁,猫。不。353144)被乱七八糟地播种,库斯库斯或密度为5000细胞/毫升的野生型细胞,在200毫升的5%(v/v)hn中,在AK中。在36-48小时的增长之后,在无菌的AK中连续三轮离心和再悬浮,将细菌从细胞中清除。最后一次清洗后,将细胞重新悬浮在总体积为100μL的AK中,并在Luna FL自动细胞计数器(Logos Biosystems)上计数。将剩余细胞稀释至最终浓度5×10。细胞/ml,分为100μl小份。每一小份细胞以2750 x g的速度造粒,再悬浮在启动缓冲液中(40 mm HEPES-KOH,pH 7.5;34毫米柠檬酸锂;50 mM L-半胱氨酸;15%(w/v)PEG 8000;和1μm木瓜蛋白酶)在室温下培养30分钟,去除细胞外包膜物质。用50 mg/ml牛血清白蛋白组分V(sigma)骤冷启动缓冲液。细胞在1250 x g的条件下造粒,再悬浮在25μl的SF缓冲液(lonza)中。通过向16μl SF缓冲液的混合物中加入2μl的“引物”细胞来制备每个转染反应。2μl 20μg/μl PUC19;1μl 250 mm ATP,pH 7.5;1μl 100 mg/ml肝素钠;每一个报告者的DNA结构中有1μl的含量为5μg/μl。用cm-156脉冲,在一个4d96孔核融合器(lonza)中的96孔核融合板(lonza)中进行了转染。在核感染之后,100μl冰冷回收缓冲液(10 mm HEPES-KOH,pH 7.5;0.9山梨醇;将8%(w/v)PEG 8000)添加到细胞中并培养5分钟。在12孔板中,将整个转染反应体积加上回收缓冲液转移到AK中的1 ml 5%(v/v)hn中。细胞恢复1小时后,5μl 10 mg冷冻E.太平洋航空公司在每口井中添加1毫升AK中的颗粒再悬浮液,如果观察玫瑰花结诱导,则添加RIF。

转基因互补

作为补充,用以下质粒对杂突变体进行了转染:(1)pefl5'-actin3':pac-p2a-jumble-mtfp(加基因ID NK694)(2)pefl5'-actin3':pac-p2a-jumbleLW1-MTFP(加基因ID NK695)(3)pefl5'-actin3':pac-p2A-mtfp-jumble(加基因ID NK696)(4)pefl5'-actin3':pac-p2A-mtfp-jumbleLW1(加基因ID NK697)(5)PEFL5'-肌动蛋白3':PAC-P2A-MTFP(添加基因ID NK676);和具有以下质粒的蒸粗麦粉:(1)pefl5'-actin3':pac-p2a-couscous-mtfp(添加基因ID NK698)(2)pefl5'-actin3':pac-p2a-couscousLW1-MTFP(添加基因ID NK699)(3)pefl5'-actin3':pac-p2A-mtfp-couscous(加基因ID NK700)(4)pefl5'-actin3':pac-p2A-mtfp-couscousLW1(加基因ID NK701)(5)PEFL5'-肌动蛋白3':PAC-P2A-MTFP(添加基因ID NK676)。转化后的细胞在转染后额外生长24小时,以允许转基因表达。然后加入40μg/ml嘌呤霉素进行筛选。选择48小时后,用血细胞仪计数玫瑰花结诱导。旋转15秒后用甲醛固定,在血细胞仪上计数每孔200个细胞,以确定玫瑰花结中细胞的百分比。(图2C图3C)。在两个生物复制品上重复互补,每个重复三个技术转染。代表性玫瑰图(图2D图形三维)采用共聚焦显微镜,利用蔡司AXIO观察者LSM 880 A C-Apochomat 40X/NA1.20 W Korr-uv-vis-ir水浸物镜进行观察。

活细胞成像

通过电晕处理和聚赖氨酸涂层制备用于活细胞成像的玻璃底培养皿,如中所述。布斯等。(2018).通过将1-2 ml细胞造粒并在200μl 4/5 asw中用100 mM Licl重新悬浮以减缓鞭毛搏动,制备转染细胞用于显微镜检查。将细胞镀在玻璃底皿上,并用200μl 20%(w/v)ficoll 400覆盖,用100 mM Licl溶解于4/5 asw中。共聚焦显微镜在蔡司AXIO观察者LSM 880上进行,该观察者带有Airyscan探测器和63X/NA1.40平面复色油浸泡物镜。

共聚焦叠加是在超分辨率模式下,利用ILEX线扫描和两倍平均以及以下设置获得的:35纳米x 35纳米像素大小,100纳米Z步0.9–1.0微秒/像素停留时间,850增益,458nm激光器,以1–6%的激光功率工作,561纳米激光器,以1–2%的激光功率工作,458/561纳米多光束分光器,和495–550纳米带通/570纳米长通滤波器。图像处理采用自动Airyscan算法(蔡司)。

凝集素染色和江淮碱定量分析

所有fitc标记的凝集素来自试剂盒I,二、以及来自病媒实验室(FLK-2100,FLK-3100,和flk-4100)在野生型中进行了识别试验。杂乱的,和Couscous(补充文件-表S5)。细胞被镀在96孔玻璃底板的聚赖氨酸涂层孔上,在浓度为1:200的条件下添加外源凝集素,并立即使用蔡司AXIO Observer.Z1/7宽视野显微镜和Hammatsu Orca Flash 4.0 LT CMOS数码相机和20倍物镜成像。用于进一步的Jacalin图像分析(图4)细胞被镀在涂有聚赖氨酸的玻璃底皿上,1:400 FITC标记Jacalin和1:200溶酶体红色DN-99(超载以显示细胞体),使用Zeiss Axio Observer LSM 880 A 63X/NA1.40平面无色素油浸泡物镜通过共聚焦显微镜立即成像。采用以下设置拍摄图像:66纳米x 66纳米像素大小,64纳米Z步0.34微秒/像素停留时间,488nm激光器,在0.2%的激光功率下工作,主增益为700,以及561纳米激光器,在0.0175%的激光功率下工作,主增益为750。15个独特的视场选择基于溶酶体染色。诱导细胞在成像前用RIF处理24小时。

要处理图像,使用IMAGEJ对Z堆栈图像进行最大投影。单个细胞的选择是基于溶酶体跟踪器能够清楚地看到水平方向的领子,并且被裁剪成只包含一个细胞。针对裁剪后的图像,确定了Jacalin通道的最大荧光强度像素,并对荧光强度进行了归一化处理。为了测量细胞体周围的Jacalin染色,仅使用溶酶跟踪器染色,从细胞环和细胞体在细胞周围的一侧相遇的点到另一侧绘制一条线,并沿该线测量荧光强度。为了比较不同的细胞,围绕细胞体绘制的线在R中进行一维插值,包括150个点,并按照线的长度进行归一化。将平均荧光强度绘制在细胞体周围绘制的线的长度上,以便于混淆。库斯库斯和野生型-rifs和+rifs,95%置信区间(图4F)。从两个生物复制中进行测量,每个条件下共有至少59个细胞。

大杂烩和蒸粗麦粉救援实验中的Jacalin定位研究(图4-图补充2)fitc结合的jacalin由于其与用于互补的mtfp融合蛋白的发射光谱重叠而不能被使用。因此,细胞用1 mg/ml生物素化的Jacalin(载体实验室,猫。不。B-1155),室温下5分钟,3000 xg造粒5分钟。一旦上清液被移除,用1:1000的链霉亲和素Alexa Fluor 647结合物(Thermo Fisher Scientific,猫。不。32357)在室温下保持5分钟,以荧光标记Jacalin。然后在3000×g的条件下将细胞颗粒化5分钟,上清液被移除,将细胞重新悬浮于ASW中并进行电镀成像。采用共聚焦显微镜,利用蔡司AXIO观察员LSM 880,采用63X/NA1.40平面复色油浸物镜对Jacalin进行定位。

野生型和突变体丛集分析

用p2A自切肽分离的纯化霉素抗性基因和mwasabi转染野生型细胞。外语教学启动子,维持在40μg/ml的puromycin中,以丰富阳性转化物。对于成块分析,同样数量的mwasabi wt细胞,或者不使用rifs,或者在分析前用rifs处理24小时,与杂波或蒸粗麦粉混合。涡旋的,并在经过BSA处理的8孔玻璃底盘上电镀。使用蔡司AXIO Observer.Z1/7宽视野显微镜和Hammatsu Orca Flash 4.0LT CMOS数码相机和40X/NA1.40平面无色差透镜在30分钟后获得DIC和荧光图像。(图1-图补充4)。

野生型和突变型生长曲线

所有细胞株均以1×10的密度进行电镀。3ml 5%(v/v)hn培养基中的细胞/ml AK。每12小时,一小部分细胞就会剧烈旋转15秒,用甲醛固定,用血细胞仪计数。曲线由两个生物复制品的平均标准差生成,每个生物复制品有三个技术复制品。(图1-图补充2)。

雅加林西斑

全细胞溶解物由1×10造粒制成。4c细胞,3000 x g,溶解缓冲液(20 mM Tris-HCl,pH 8;150 mM KCl;5 mMgCl 2;250 mM Sucrose;1毫米DTT;10毫米地高辛;1 mg/ml肝素钠;1 mm的pefabloc SC;0.5 U/μl DNA酶;1 U/μl超级酶)。细胞在冰上溶解缓冲液中孵育10分钟,并通过30g针5x。不溶性物质在6000 x g下在4c下造粒10分钟。裂解物(1×10)细胞/样品在4×20% TGX迷你凝胶(Bio Rad)上运行200分钟,45分钟,并用半透光25min的Ti-Trink涡轮转移系统(Bio RAD)转移到0.2μm硝酸纤维素膜上。用Odyssey-PBS阻滞法(LI-COR)将斑点封闭30分钟。用生物素化的Jacalin(1:4000;载体实验室)和E7抗微管蛋白抗体(1:10000;发育研究杂交瘤库)稀释1小时,然后用Irdye 800 Streptavidin(1:1000;李聪)和Irdye 700小鼠(1:1000;li cor)在PBST中[带%1吐温20(v/v)的PBS]。在Licor Odyssey上成像斑点。(图4-图补充件1)。

无花免疫荧光染色及成像

免疫荧光(图4-图补充3)之前在莱文等人。(2014)为更好地保存细胞骨架所做的修改如布斯等。(2018).两毫升浓野生型,混乱,还有蒸粗麦粉细胞,或者是未受教育的,或者是被RIF诱导24小时的,我们被允许在聚赖氨酸涂层的盖片(bd生物科学)上停留30分钟。细胞固定分两步进行:6%丙酮在细胞骨架缓冲液(10 mM MES,pH 6.1;138 KCl,3毫米氯化镁;2毫米EGTA;675 mm蔗糖)5 min,然后4%甲醛在细胞骨架缓冲液中稀释20 min。用细胞骨架缓冲液轻轻清洗三次盖玻片。细胞被渗透缓冲液渗透[100 mm管道,pH 6.95;2毫米EGTA;1毫米氯化镁;1%(w/v)牛血清白蛋白组分v;0.3%(v/v Triton X-100)]30分钟。在3.125 ng/μl(1:400)的浓度下,用抗Rosetteless基因组抗体对细胞进行染色。E7抗微管蛋白抗体(1:1000;发育研究杂交瘤库)Alexa Fluor 488抗鼠和Alexa Fluor 647抗兔二级抗体(各1:1000;分子探针)以及6 U/ml罗丹明-拟单抗(分子探针),然后用DAPI(分子探针)安装在延长金防伪试剂中。

图像是在蔡司LSM 880 Airyscan共聚焦显微镜上通过超分辨率模式的帧扫描获得的,目标为63x(如活细胞成像所述),设置如下:30纳米x 30纳米像素大小;100 nm z阶跃;561纳米激光器,功率为1.5%,主增益为700,488nm激光器,功率2.0%,主增益800。用633nm激光在0.3%激光功率和650主增益下对野生型玫瑰花结进行成像,以防止玫瑰花结过度暴露。但在633纳米通道中,所有其他条件都在2%的激光功率和650主增益下工作。

工具书类

  1. 1个
  2. 细胞粘液霉菌(第2版)
    1. 邦纳
    (1967)
    普林斯顿大学出版社。
  3. 粘液盘基网柄菌。粘液菌属的新组织
    1. 奥布雷菲尔德
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  4. 十一
  5. 十二
  6. 十三
  7. 十四
  8. 十五
  9. 十六
  10. 十七
  11. 十八
  12. 十九
  13. 二十
  14. 二十一
  15. 二十二
  16. 二十三
  17. 二十四
  18. 二十五
  19. 二十六
  20. 二十七
  21. 二十八
  22. 二十九
  23. 三十
  24. 三十一
  25. 三十二
  26. 三十三
  27. 三十四
  28. 三十五
  29. 三十六
  30. 三十七
  31. 三十八
  32. 三十九
  33. 四十
    海绵细胞聚集
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    2. RK赞恩
    3. 库雷克
    4. 我米勒
    5. 格伦布鲁克
    6. 普瓦斯
    (1979)
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  34. 四十一
  35. 四十二
  36. 四十三
  37. 四十四
  38. 四十五
  39. 四十六
  40. 四十七
  41. 四十八
  42. 四十九
  43. 五十
  44. 五十一
  45. 五十二
  46. 五十三
  47. 五十四
  48. 五十五
    蛋白质O-甘露糖基化
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    Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-一般受试者 一千四百二十六:297—307。
    网址:https://doi.org/10.1016/S0304-4165(98)00131-7
  49. 五十六
  50. 五十七
  51. 五十八
  52. 五十九
  53. 六十
  54. 六十一
  55. 六十二
  56. 六十三
  57. 六十四
  58. 六十五
  59. 六十六
  60. 六十七
  61. 六十八
  62. 六十九
  63. 七十

判决书

  1. 阿尔瓦拉多
    审查编辑;Stowers医学研究所,美国
  2. 玛丽安·勃朗纳
    高级编辑;加州理工学院美国

为了提高透明度,188bet体育电竞eLife包括编辑决定书和随附的作者回复。显示了同行评审后发送给作者的信的一个经过轻微编辑的版本,表示最实质性的关切;通常不包括次要评论。

感谢您提交您的文章“糖基转移酶促进发育和防止初鞭毛虫的滥交细胞聚集”S.罗塞塔“供考虑188bet体育电竞.你的文章已经过两位同行评审,评估由一位评论编辑和玛丽安·布朗纳(MarianneBronner)担任高级编辑进行监督。以下参与审查你提交材料的个人同意透露他的身份:I_aki ruiz trillo(审查员1)。

审阅者彼此讨论了审阅,审阅编辑起草了此决定以帮助您准备修订的提交。

总结:

这项研究的高级手稿建立在188bet体育电竞由同一组人鉴定和鉴定了无花鞭毛虫中的无花基因。S.罗塞塔.在这里,作者报道了一种新发现的鞭毛虫的基因筛选方法。罗塞塔萨尔皮戈卡目的鉴定对鞭毛虫菌落发育至关重要的基因。使用批量Segregant分析,确定了两个编码假定糖基转移酶的基因(杂合子和粗麦粉)。测序,以及地图数据和补充研究是健全的。突变体破坏了玫瑰花结的正常模式,反而导致细胞团块。作者的结论是,他们的发现表明前后生动物的作用,糖基转移酶在调节发展。

基本修订:

1)一个主要关注的是杂合子和表兄弟突变体的聚集行为。目前尚不清楚所提供的数据是否表明,杂音和表音是通过聚集形成的。很明显,一旦它们被分解,它们聚集在一起再次形成团块。但是原始的团块呢?它们真的是由聚合形成的吗?也许我们错过了什么,但不可能是克隆分裂形成的原始表兄弟和杂乱的团块吗?这需要更清楚地解释。

2)另一个可以改进的领域是凝集素定位数据。

凝集素Jacalin在杂合子和蒸粗粉突变体中的错误定位是有趣的。这种定位是通过互补恢复到野生型吗?或者与遗传交叉后的突变有关?在无玫瑰突变体或其他两个不能在这里映射的突变体中呢?肥皂水和海泡石?缺少补充数据,或遗传连锁数据,或两个独立突变体的一致表型,观察到的突变表型可能或可能与可疑的致病突变无关。

网址:https://doi.org/10.75188bet体育电竞54/elife.41482.054

作者回复

基本修订:

1)一个主要关注的是杂合子和表兄弟突变体的聚集行为。目前尚不清楚所提供的数据是否表明,杂音和表音是通过聚集形成的。很明显,一旦它们被分解,它们聚集在一起再次形成团块。但是原始的团块呢?它们真的是由聚合形成的吗?也许我们错过了什么,但不可能是克隆分裂形成的原始表兄弟和杂乱的团块吗?这需要更清楚地解释。

为了进一步调查,我们用细胞周期抑制剂测试了杂合子和粗粉突变体细胞分裂成丛的必要性。蚜虫素蚜虫胺可防止细胞分裂,但不能防止团块和蒸粗麦粉形成(见新图1-图补充1)。因此,成丛不需要细胞分裂。虽然在形式上是可能的,很可能,细胞分裂部分地促进了成束。生长长时间(>6小时,细胞倍增所需的时间),因为簇内的细胞分裂,单是聚集就足以引发和生长团块。

我们增加了图1-图补充件1,并将文本修改为:

此外,用细胞周期抑制剂aphidicolin阻断细胞分裂并不能阻止凝块的形成(图1-图补充1)。确实……所测试的每个突变体在细胞增殖中也显示出轻微的缺陷(图1-图补充2)。

2)另一个可以改进的领域是凝集素定位数据。

凝集素Jacalin在杂合子和蒸粗粉突变体中的错误定位是有趣的。这种定位是通过互补恢复到野生型吗?或者与遗传交叉后的突变有关?在无玫瑰突变体或其他两个不能在这里映射的突变体中呢?肥皂水和海泡石?缺少补充数据,或遗传连锁数据,或两个独立突变体的一致表型,观察到的突变表型可能或可能与可疑的致病突变无关。

检测突变是否在混乱库斯库斯是导致在杂合子和蒸粗粉突变体中观察到的Jacalin误导的原因(图4)。我们研究了姜碱在转基因互补玫瑰花结中的定位。

用阴性对照法改造杂碎和粗麦粉-MTFP未恢复杂细胞和表兄弟细胞基极的Jacalin染色(见新图4-图补充2g,我)但是玫瑰花结通过与任何一种转基因植物的互补而恢复。MTFP杂波库斯科MTFP在玫瑰花结的中心显示出强烈的Jacalin染色(图4-补充图2h,J)。因此,混乱库斯库斯足以恢复补体玫瑰花结中的野生型糖基化模式。

我们增加了图4-图补充2,并将文本修改为:

“混合细胞的转化MTFP杂波不仅挽救了玫瑰花结的发展(图2c,d)还恢复了野生型糖基化模式,如补充玫瑰花结中心的Jacalin染色所示(图4-图补充2)。[…]因此,杂合子和粗麦粉突变体细胞的糖基化缺陷与基因损伤直接相关。混乱库斯库斯

网址:https://doi.org/10.75188bet体育电竞54/elife.41482.055

文章和作者信息

作者详情

  1. 劳拉-韦泽尔

    1. 分子与细胞生物学系,加利福尼亚大学伯克利伯克利美国
    2. 霍华德休斯医学院,加利福尼亚大学伯克利伯克利美国
    贡献
    概念化,数据规约,形式分析,验证,调查,可视化,方法论,起草原稿,写作评论与编辑
    竞争性利益
    未宣布竞争利益
    奥西德图标 “此orcid id标识本文作者:”0000-0003-0391-2542号
  2. 泰拉C列文

    1. 分子与细胞生物学系,加利福尼亚大学伯克利伯克利美国
    2. 霍华德休斯医学院,加利福尼亚大学伯克利伯克利美国
    贡献
    概念化,调查,写作评论与编辑
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    奥西德图标 “此orcid id标识本文作者:”0000-0001-7883-8522号
  3. 瑞安·E·哈利特

    1. 分子与细胞生物学系,加利福尼亚大学伯克利伯克利美国
    2. 霍华德休斯医学院,加利福尼亚大学伯克利伯克利美国
    贡献
    调查
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  4. 陈晓东

    1. 分子与细胞生物学系,加利福尼亚大学伯克利伯克利美国
    2. 霍华德休斯医学院,加利福尼亚大学伯克利伯克利美国
    贡献
    调查
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  5. 授予国王

    1. 分子与细胞生物学系,加利福尼亚大学伯克利伯克利美国
    2. 霍华德休斯医学院,加利福尼亚大学伯克利伯克利美国
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    调查,可视化
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  6. 珊瑚礁

    1. 分子与细胞生物学系,加利福尼亚大学伯克利伯克利美国
    2. 霍华德休斯医学院,加利福尼亚大学伯克利伯克利美国
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    调查
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  7. 戴维展位

    1. 分子与细胞生物学系,加利福尼亚大学伯克利伯克利美国
    2. 霍华德休斯医学院,加利福尼亚大学伯克利伯克利美国
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    概念化,调查,方法论,写作评论与编辑
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  8. 莫妮卡·阿贝丁·西格

    1. 分子与细胞生物学系,加利福尼亚大学伯克利伯克利美国
    2. 霍华德休斯医学院,加利福尼亚大学伯克利伯克利美国
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    概念化,调查,方法论,项目管理,写作评论与编辑
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  9. 妮科尔国王

    1. 分子与细胞生物学系,加利福尼亚大学伯克利伯克利美国
    2. 霍华德休斯医学院,加利福尼亚大学伯克利伯克利美国
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    概念化,监督,资金收购,起草原稿,项目管理,写作评论与编辑
    用于通信
    邮箱:nking@berkeley.edu
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    未宣布竞争利益
    奥西德图标 “此orcid id标识本文作者:”0000-0002-6409-1111号

基金

霍华德休斯医学院

  • 劳拉-韦泽尔
  • 泰拉C列文
  • 瑞安·E·哈利特
  • 陈晓东
  • 授予国王
  • 珊瑚礁
  • 戴维展位
  • 莫妮卡·阿贝丁·西格
  • 妮科尔国王

简·科芬儿童医学研究纪念基金会(西蒙斯研究员)

  • 戴维展位

资助者在研究设计中没有作用,数据收集和解释,或者决定将作品提交出版。

确认

Hannah ElzingaLily Helfrich马克斯柯伊尔协助实验和试剂制备。感谢Iswar Hariharan和国王实验室的成员提供了有益的讨论,研究支持,变异命名建议,对手稿的评论,尤其是凯莉·哈克,Ben LarsonTess Linden还有蒂博·布鲁内。这项工作使用了加州大学伯克利分校的文森特·J·考茨基因组测序实验室,由NIH S10 OD018174仪器拨款支持。

高级编辑

  1. 玛丽安·勃朗纳,加州理工学院美国

审阅编辑器

  1. Alejandro S_nchez Alvarado,Stowers医学研究所,美国

出版历史

  1. 收到时间:9月5日二千零一十八
  2. 接受日期:12月14日二千零一十八
  3. 已接受的稿件发布:12月17日,2018(第1版)
  4. 发布的记录版本:1月7日,2019(第2版)

版权

2018,韦泽尔等。

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韵律学

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