1. 发育生物学
  2. 神经科学
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Transcriptomic and epigenetic regulation of hair cell regeneration in the mouse utricle and its potentiation by Atoh1

  1. 辛吉仁
  2. 马修克希尔
  3. 陶利涛
  4. 盛伟伟
  5. 曹文建
  6. 张宏远
  7. 郝泽宇
  8. 胡安骆驼
  9. 程杭宗
  10. 杰姆斯·F·马丁
  11. 尼尔塞吉尔
  12. 安得烈K树林 是通讯作者
  1. Baylor College of Medicine,美国
  2. 南加州大学美国
  3. 德克萨斯心脏研究所,美国
研究文章
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引用本文as:188bet体育电竞Elife 2019;8:E44328 DOI:10.7554/188bet体育电竞埃利夫44328

摘要

The mammalian cochlea loses its ability to regenerate new hair cells prior to the onset of hearing.In contrast,the adult vestibular system can produce new hair cells in response to damage,或用毛细胞转录因子ATOh1对支持细胞重新编程。我们用RNA-seq和ATAC-seq来探讨胞外支持细胞的转录和表观遗传学反应对损伤和ATOh1转导的影响。我们发现,与耳蜗对应细胞相比,胞核的再生反应与胞核支持细胞中更易接近的染色质结构相关。我们还提供了支持细胞的ATOh1转导能够促进某些毛细胞基因的转录可及性增加的证据。Our study offers a possible explanation for regenerative differences between sensory organs of the inner ear,但表明,ATOh1的附加因子可能是优化毛细胞命运重新编程所必需的。

网址:https://doi.org/10.75188bet体育电竞54/elife.44328.001

介绍

感觉毛细胞是存在于脊椎动物内耳和侧耳器官的非常敏感的机械传感器。它们极易受到环境噪声暴露造成的机械损伤,以及耳毒性氨基糖苷类抗生素和含铂化疗药物。(Oesterle二千零一十三利伯曼二千零一十六弗朗西斯和坎宁安,二千零一十七江等人,二千零一十七利伯曼二千零一十七SH等人,二千零一十七).非哺乳动物脊椎动物能够再生大量的毛细胞,并在震耳欲聋后获得令人印象深刻的功能恢复。(Brignull等人,二千零九Ryales等人,二千零一十三梦露等人,二千零一十五),通过不断自我更新,自然补充前庭和侧线感觉器官中的毛细胞。(Corwin1981Corwin1985J_rgensen和Mathiesen,一千九百八十八Roberson等人,一千九百九十二KIL等人,一千九百九十七).这些再生过程包括动员邻近的支持细胞重新进入细胞周期并转化为毛细胞。(科坦切一千九百八十七Corwin and Cotanche,一千九百八十八黑麦和卢布,一千九百八十八石头和雪崩,二千零七).In contrast,哺乳动物的听觉器官,科蒂的器官,自发性再生能力极为有限,这只在未成熟或胚胎哺乳动物身上观察到。(Kelley等人,一千九百九十五Bramhall等人,二千零一十四Cox等人,二千零一十四阿特金森等人,二千零一十五).这种再生失败促使人们尝试促进哺乳动物毛细胞的再生。各种各样的操作,主要在未成熟的小鼠和大鼠中进行,能诱导新生儿支持细胞分裂、转化为毛细胞样细胞(阿特金森等人,二千零一十五).这包括在分离细胞培养中放置支持细胞。(White et al.,2006Oshima et al.,二千零七Sinkkonen et al.,2011),抑制Notch信号通路,典型Wnt信号通路的激活(石等,二千零一十三阿特金森等人,二千零一十五Kuo等人,二千零一十五马斯等人,二千零一十五扎克等人,二千零一十五Hu et al.,二千零一十六马斯等人,二千零一十六倪等,二千零一十六).此外,强迫表达毛细胞特异性转录因子atoh1可导致耳蜗的支持细胞和非感觉细胞转化为毛细胞样细胞。(郑和高二千Kawamoto等人,二千零三Izumikawa et al.,二千零五赵等,2011凯莉等人,二千零一十二杨等人,2012A杨等人,2012BChen et al.,二千零一十三阿特金森等人,二千零一十四Kuo等人,二千零一十五李等人,二千零一十七).However,当皮质器官成熟时,哺乳动物耳蜗对这些不同的操作变得难以控制,而且在听力开始后几乎不能诱导再生。(凯莉等人,二千零一十二刘等人,二千零一十二).由于在这一时期,皮质醇的器官既没有添加也没有替换支持细胞,耳蜗支持细胞的成熟可能是其未能分化为毛细胞的原因。However,这种成熟的机制基础仍然是难以捉摸的。

与哺乳动物耳蜗相比,成熟的哺乳动物前庭器官能力非常有限,但重要的是,受损后持续的毛细胞生成和再生量(Forge et al.,一千九百九十三Ruell等人,一千九百九十五Kuntz和Osterle,一千九百九十八OgATA等,一千九百九十九Kawamoto等人,二千零九林等人,2011戈卢布等,二千零一十二).在成年哺乳动物胞囊中观察到少量未成熟毛细胞,including in humans (泰勒等人,二千零一十五),最近使用的谱系追踪技术清楚地表明,在成年小鼠胞囊中,少量的支持细胞可以转化为类似于Ⅱ型毛细胞的细胞。每周大约添加两个毛细胞(Bucks et al.,二千零一十七).实验杀死毛细胞后,这种替换率显著增加。(Bucks et al.,二千零一十七).成体胞囊中的毛细胞产生与哺乳动物胚胎毛细胞形成过程中观察到的毛细胞产生表面上相似:它涉及AToH1转录因子的上调,由Notch信号通路调节(王等,二千零一十林等人,2011戈卢布等,二千零一十二Bucks et al.,二千零一十七).Indeed,overexpression of the Atoh1 transcription factor in normal or ototoxin-treated adult utricle organ cultures or immature mice leads to a robust production of hair cell-like cells (寿等,二千零三高等人,二千零一十六泰勒等人,二千零一十八).

这些结果提出了一些问题,关于成熟的支持细胞有助于毛细胞再生的能力,以及ATOh1增强这种再生的能力。第一,what is the transcriptional response of supporting cells to hair cell loss,在没有明显的毛细胞产生的情况下,这些细胞中的毛细胞分化程序是否有任何方面被激活?第二,毛细胞样细胞是否在损伤后在胞囊内自发产生?或在ATOh1转导后,善意的hair cells,与支持细胞毛细胞杂交相比?第三,为什么成熟的胞囊支持细胞明显比耳蜗支持细胞更有能力转化成毛细胞?在本研究中,我们已经用一个毛细胞损伤的胞外器官培养模型来解决这些问题,结合RNA序列和ATAC序列分析支持细胞。我们发现,单是毛细胞丢失就导致了支持细胞中许多特征性毛细胞基因的上调。although these cells do not express typical hair cell markers such as Myosin7a.用表达ATOh1的腺病毒转导这些培养物可诱导大量表达肌球蛋白7a的毛细胞样细胞,并进一步扩大上调毛细胞基因的数量。结果表明,支持胞囊细胞的毛细胞基因座染色质比成熟耳蜗的毛细胞基因座染色质更易接近。支持细胞的ATOh1转导可以使一些毛细胞基因座的染色质更容易获得。However,Atoh1 transduction is unable to achieve complete conversion of supporting cells to hair cells,我们发现与成熟毛细胞相关的基因在我们重新编程的支持细胞中表达不足。这表明,除了AToH1,其他转录效应器是必要的,以完全重新编程支持细胞成毛细胞。

结果

用RNA序列鉴定成人胞囊毛细胞和支持细胞特异性转录物

As a first step to understanding the transcriptional responses of mature utricle supporting cells during injury and regeneration,we assembled transcriptional profiles of hair cells and supporting cells from the intact utricle.我们穿越ATOH1-CRERT2小鼠(Machold和Fishell,二千零五)用AI3 CRE报告老鼠(麦迪逊等人,二千零一十)并将他莫昔芬从p10输送至p14,用eyfp标记毛细胞。(图1A).三周后,我们解剖了标记的胞浆,并用gfp和myosin7a抗体来显示大约80%的胞浆毛细胞被这种方法标记。(图1-图补充1a).这让我们可以对eyfp进行排序+用于RNA序列分析的毛细胞(图1A).用支持细胞标记对纯化毛细胞群进行流式细胞术分析,结果显示支持细胞不到1%。(图1-图补充2a图1-图补充2b).分离胞果支持细胞,我们利用了CD326,a 40 kDa mouse EpCAM glycoprotein is expressed by both utricle hair cells and supporting cells but not underlying stromal cells (Hertzano等人,2011Sinkkonen et al.,2011图1-图补充1b).从毛细胞和基质细胞中分离支持细胞,we crossedGFI1-CRE小鼠(杨等人,二千零一十)用AI3-Cre报告小鼠用eyfp标记毛细胞,然后标记分离的细胞GFI1-CRE;具有CD326抗体和分类CD326+的AI3胞体,用于RNA序列分析的eyfp-支持细胞(Figure 1B).对纯化的支持细胞群的流式细胞术分析显示,完全没有Eyfp+毛细胞。(图1-图补充2c图1-补充图2d).

图1含2种补充剂 看到一切
通过facs排序和RNA测序鉴定独特的胞毛细胞和支持细胞转录。

分离胞果毛细胞和支持细胞的育种和FACS纯化策略图。()为了分离胞果毛细胞,AI3报告老鼠携带ATOH1转基因在10岁时接受三苯氧胺注射,出生后12天和14天。从1-2个月大的动物中分离出表达gfp的毛细胞。(B)为了分离支持细胞,AI3报告老鼠携带GFI1-CRE转基因在1-2个月大时被处死,and the dissociated cells labeled with anti-CD326 conjugated to allophycocyanin (APC).通过对CD326+进行分类,分离出支持细胞。gfp-人口(红色)。(C)利用deseq2鉴定胞外毛细胞和支持细胞中的差异表达基因。根据倍数变化>4和调整后的p值<0.05确定差异表达基因。Gene ontology analysis of (GO) analysis of enriched pathways or keywords in each cell population was performed with the DAVID analysis tool using 1912 hair cell-enriched genes and 2619 supporting cell-enriched genes.

https://doi.org/10.7554/188bet体育电竞eLife.44328.002

对纯化的胞毛细胞和支持细胞进行RNA序列分析后,我们进行了差异表达分析,发现1912份转录物在胞果毛细胞中富集4倍以上,2619份转录物在支持细胞(adj)中富集4倍以上。P<0.05;Figure 1C).为了验证我们的基因列表,我们将我们的丰富的毛细胞和支持细胞基因列表与先前研究中确定的基因进行了比较。(图1-源数据1).在前100个丰富的胞果毛细胞基因中,有70个已经在毛细胞的转录或蛋白质组学研究中报道过。(蔡等,二千零一十五谢弗等,二千零一十五希科克斯等人,二千零一十七).尽管支持细胞的转录组不如毛细胞的转录组具有更好的特征,of our top 100 supporting cell-enriched genes,47以前被证明在支持耳蜗的细胞中有表达。(马斯等人,二千零一十六图1-源数据1).

腺病毒特异性感染成人前庭系统的支持细胞

过度表达ATOH1在受损的胞果中,形成新的毛细胞样细胞。(寿等,二千零三泰勒等人,二千零一十八).了解支持细胞对毛细胞丢失和转导的反应。ATOH1我们开发了一种腺病毒系统,专门感染和标记支持细胞。我们使腺病毒血清型5(de1)载体携带番茄,a red fluorescent protein,在EF1α启动子的控制下(图2A).我们选择了这种血清型,因为以前的研究表明它特异性地感染成人胞囊支持细胞。(布兰登等人,二千零一十二).A second vector also incorporated a full lengthATOH1cDNA将一个自切碎的微小病毒t2A肽序列插入番茄ATOH1制造两种功能蛋白。293T细胞用控制病毒(Ad-Td番茄)和Atoh1病毒(Ad-Td番茄-Atoh1)转导,以验证其表达。转导两天后,我们进行免疫染色和蛋白质印迹分析,以证实293T细胞成功表达所需的蛋白质。(图2B和C).为了确认我们的腺病毒专门针对支持细胞,we infected mature utricle explants from 1 to 2 month old mice with Ad-tdTomato.感染两天后,用Myo7a和Sox2抗体固定和染色胞外植体。(图2D).几乎没有感染细胞表达毛细胞标记myo7a;out of two explants analyzed,我们只观察到一个共同表达myo7a蛋白的td番茄表达细胞。表明我们的腺病毒特异性感染成熟胞外植体中的支持细胞。

图2含2种补充剂 看到一切
ATOh1的过度表达诱导成人胞囊中的毛细胞样细胞。

) Diagram of adenoviral vector constructs expressing tdTomato (Ad-TOM) and tdTomato and Atoh1 (Ad-Atoh1).ITR:倒置的末端重复序列,t2a:微小病毒t2a序列。(B)293t细胞感染Ad-Tom或Ad-Atoh1病毒后的td番茄和Atoh1蛋白的免疫荧光染色。Scale bar,50μmC) Western blots for expression of tdTomato in 293 T cells infected with Ad-TOM or Ad-Atoh1 viruses.Duplicate lanes are shown for each condition.(D) Immunofluorescence staining for hair cell (Myo7a-cytoplasmic staining) and supporting cell (Sox2-nuclear staining) markers on utricle explants treated with Ad-tdTomato.48小时后,没有td番茄+细胞表达myo7a,而所有td番茄+细胞都表达sox2。Optical sections are taken through the cell body at the level of the nucleus.Scale bar,100μm。(e) Infection of supporting cells with Ad-Atoh1 virus induces expression of the hair cell marker Myosin7a.检查胞浆培养物3,感染后5天和10天,用TD番茄标记被感染的细胞。插图用黄色正方形显示了封闭区域的放大图像。Scale bar,50 µm.(F)每40x田地的td番茄+细胞数(42750 um2)在10天的培养期间,表达myo7a增加。Error bars show mean ± SEM (n ≥ 6 utricles).(G)在10天的培养期间,表达myo7a的td番茄+细胞的百分比增加。Error bars show mean ± SEM (n ≥ 6 utricles).(H)获得RNA序列和ATAC序列的td番茄和AToH1表达细胞的实验程序示意图。(I)在病毒感染的胞外培养物中显示出td番茄阳性细胞(红色)的分布。(J)感染细胞的q-pcr分析显示,无论是Ad-Tom病毒还是Ad-Atoh1病毒,td番茄都有很强的表达。但只有在Ad-Atoh1感染的培养物中才表达Atoh1。误差条显示平均值±sem(n=3)(*p<0.05;与阴性对照组相比,p<0.01)。(K) Hair cell transcripts (Myo7a and Myo6) are up-regulated in Ad-Atoh1-infected cultures,但不能控制(ad-tom)培养(n=3)(*p<0.05;*p<0.01)。

网址:https://doi.org/10.75188bet体育电竞54/elife.44328.006

成熟的哺乳动物胞囊几乎没有自发的毛细胞再生。(锻造,1985Forge et al.,一千九百九十三李等,一千九百九十五Ruell等人,一千九百九十五Lambert et al.,一千九百九十七李和福格一千九百九十七Forge et al.,一千九百九十八Kirkegaard和J_rgensen,二千),ATOh1在未受损的成年小鼠胞囊中的表达不会产生大量的毛细胞。(高等人,二千零一十六).因此,为了研究毛细胞死亡后的自发再生机制,我们建立了胞外器官培养系统来杀死毛细胞。我们用不同浓度的庆大霉素(0.1 mm,0.5毫米,1 mm和2 mm)24小时。我们用新鲜的培养基清洗外植体,在没有庆大霉素的情况下培养外植体5天。24小时暴露于庆大霉素导致胞外毛细胞显著减少,呈剂量依赖性。(图2-图补充1a).我们观察到,用1 mM庆大霉素处理24小时后,培养的支持细胞出现异常。elongated morphology after 5 days (图2-图补充1b).In contrast,用0.1 mM庆大霉素处理24小时的培养物在5天后失去了大量的毛细胞。but the remaining supporting cells retained a normal morphology (图2-图补充1b).用0.1 mM庆大霉素治疗24小时内开始凋亡,用caspase-3酶底物孵育测定(图2-图补充2a-cCunningham等人,二千零二).因此,我们在所有后续实验中使用0.1 mm庆大霉素24小时。

To confirm that our Atoh1 virus could induce utricle supporting cells to trans-differentiate into hair cells after hair cell death,在庆大霉素治疗后一天,我们用Ad-Td番茄或Ad-Atoh1-Td番茄感染支持细胞。在感染ad-atoh1-td番茄病毒的培养基中,we began to observe clear Myo7a staining in about 45% of infected supporting cells five days after transduction (Figure 2E).虽然感染细胞的数量在10天后在每个培养的胞果之间有所不同,在我们的培养基中,我们通常能看到100到600 td番茄+细胞。在用ad-atoh1-td番茄病毒转导10天后,80%以上的感染细胞表达myo7a。(图2E-G),而感染Ad-Td番茄病毒的细胞在感染后10天内仍呈myo7a阴性。(图2-图补充1b).Our virally infected cells could be purified by FACS sorting for the tdTomato reporter (图2H图2I).RT-qpcr验证表明,与td番茄阴性支持细胞相比,td番茄阳性支持细胞中的td番茄转录物丰富了20倍。(Figure 2J)和ATOh1转录物仅在从Ad-TD番茄-ATOh1感染外植体分离出的Td番茄阳性支持细胞中富集。(Figure 2J).

支持胞核细胞在毛细胞死亡后上调毛细胞基因

哺乳动物胞囊支持细胞能够在毛细胞死亡后进行一定程度的自发再生,形成毛细胞样细胞。(Forge et al.,一千九百九十三Ruell等人,一千九百九十五Kuntz和Osterle,一千九百九十八OgATA等,一千九百九十九Kawamoto等人,二千零九林等人,2011戈卢布等,二千零一十二Bucks et al.,二千零一十七).此外,ectopic expression ofATOH1能诱导成熟胞囊和新生儿耳蜗毛细胞样细胞的形成。(郑和高二千Kawamoto等人,二千零三寿等,二千零三Izumikawa et al.,二千零五赵等,2011凯莉等人,二千零一十二杨等人,2012A杨等人,2012BChen et al.,二千零一十三阿特金森等人,二千零一十四Kuo等人,二千零一十五高等人,二千零一十六李等人,二千零一十七泰勒等人,二千零一十八).到目前为止,however,支持胞核细胞对损伤的转录反应ATOH1尚未评估转导。

To test the extent to which supporting cells up-regulate hair cell genes in our gentamicin-damaged utricle organ cultures,以及是否可以通过ATOH1我们用Ad-Td番茄或Ad-Td番茄-Atoh1病毒感染4周大的胞果。用Facs纯化感染的td番茄+细胞,并将各组的转录物与内源性胞毛细胞和支持细胞的转录物进行比较。(Figure 1C).果不其然,principal component analysis showed that Ad-tdTomato infected cells occupied an intermediate transcriptional space between utricle hair cells and supporting cells,而Ad-td番茄-atoh1感染的细胞更像内源性胞毛细胞。(图3A).

图3含2种补充剂 看到一切
前庭上皮损伤后支持细胞中毛细胞富集基因和细胞周期基因的激活。

)原理成分分析(PCA)图,使用来自内源性胞外毛细胞的RNA序列数据的标准化计数,胞囊支持细胞,或胞外支持细胞感染了ad-td番茄或ad-atoh1。PCA解释了总方差的33.7%(PC1)和29.7%(PC2)。(B)heatmap比较不同组间所有富含毛细胞基因的基因表达水平。根据病毒感染组与支持细胞的相对表达将基因分为三组。基因组分为三组:毛细胞基因在支持细胞中不被激活;毛细胞基因被ATOh1损伤和转导激活;毛细胞基因仅由损伤激活。每一组都有已知基因的例子。(C)文氏图比较了富含毛细胞的基因和富含Ad-Td番茄或Ad-Atoh1感染的支持细胞的基因。基因本体分析使用仅在Ad-Atoh1感染细胞中富集的基因的富集途径或关键词(绿色),enriched in Ad-tdTomato infected cells (pink) and only enriched in utricle hair cells (purple).

https://doi.org/10.7554/188bet体育电竞eLife.44328.009

我们发现,在用庆大霉素短暂治疗10天后,Ad-Td番茄感染的支持细胞上调了大量的毛细胞基因。(图3B).我们鉴定了599个在治疗后上调的毛细胞转录本。We used gene ontology (GO) analysis to describe the functional characteristics of genes up-regulated by culture and hair cell loss.尽管大多数上调的毛细胞基因到目前为止还没有得到广泛的表征,最热门的包括DNA修复的基因组(go:0006281;24个基因,p=5.02E-6),cytoskeleton (GO:0005856;53个基因,P=1.11E-5)和细胞投射(Go:0042995;36个基因,p=1.21E-4;图3C).

过度表达ATOH1增强支持细胞向毛细胞样细胞的转化分化

我们的研究结果表明,支持胞核的细胞首先诱导参与毛细胞修复和重塑的基因。but stop short of overt trans-differentiation to hair cell-like cells,因为它们不能表达肌球蛋白7a等标记。果不其然,在接受Ad-td蕃茄-atoh1病毒的培养中,大多数受损伤上调的基因也上调。(图3B,454个基因)。However,胞囊培养物的转导ATOH1诱导了另外346个毛细胞基因。(图3B,C).其中112个基因似乎是毛细胞的通用标记物,as they are also expressed in neonatal cochlear hair cells (蔡等,二千零一十五图3-图补充1a).这些毛细胞基因中有35个被AToH1上调,如图所示。Figure 3—figure supplement 1B.对Atoh1诱导的胞外支持细胞中346个额外的毛细胞基因进行Go分析,发现了几个显著丰富的途径,包括纤毛基因组(Go:0005929;12个基因,P=84E-4)纤毛运动(go:0003341;five genes,p=0.0012)和syntaxin结合(go:0019905,六个基因,p=0.004).合在一起,我们的研究结果表明,与仅由毛细胞死亡和培养诱导的细胞相比,ATOh1足以激活成人胞囊支持细胞中额外的毛细胞基因。

尽管许多毛细胞基因在损伤后的支持细胞中上调,并且ATOH1转导,many other utricle hair cell genes (967 out of 1912 genes) were not significantly up-regulated in utricle supporting cells in either of these conditions (图3B,C).我们对这些毛细胞基因进行了Go分析,发现大量与毛细胞成熟或功能相关的基因。其中许多基因与go术语“立体纤毛”相关(go:0032420;11个基因,P= 4.7E-7)‘detection of mechanical stimulus involved in sensory perception of sound' (GO:0050910;六个基因,p=4.46E-4) and ‘auditory receptor cell stereocilium organization' (GO:0060088;七个基因,p=6.86E-6).We also compared our gene list to the proteins that have been previously identified in the stereociliary bundle of chick vestibular hair cells (希恩等,二千零一十三).38个编码鸡胞质毛束丰富蛋白的基因也存在于我们纯化的胞质毛细胞中。其中一些发束基因也富含Ad-Td番茄(11个基因)或Ad-Td番茄-Atoh1(10个基因)处理的细胞。However,大多数以前的特征性发束基因在任何一种情况下都不能被诱导,这表明尽管atoh1可以上调许多毛细胞基因,它似乎不促进与毛细胞成熟特征相关的基因表达。因此,尽管我们的Atoh1感染细胞表达诸如肌球蛋白7a等标记物,经10天培养后,荧光显微镜观察不到明显的顶端肌动蛋白丝组织成立体纤毛样过程。

我们还观察到,Ad-Td番茄-Atoh1病毒对成熟毛细胞中不存在的大量基因(440个基因)的感染上调。也不受毛细胞损伤和单独培养的上调。(图3C).由于ATOh1在小脑颗粒细胞等其他类型的细胞中也起转录因子的作用,肠道分泌细胞和皮肤的默克尔细胞,我们通过检查这些组织公布的数据集,询问了440个由ATOh1激活的基因中是否有任何一个在其他表达ATOh1的细胞中也有丰富的表达。尽管这些440个基因中的一些确实在小脑颗粒细胞中表达。(KLISCH等,2011),肠道分泌细胞(L.等,二千零一十七)或默克尔细胞(Haeberle等人,二千零四),我们还发现440个基因中有一些在不表达AToH1的细胞群中表达,such as smooth muscle (Himes et al.,二千零一十四)和肾(哈布卡等,二千零一十四)与表达ATOh1的组织比例相似。(图3-图补充1c).因此,it is unlikely that Atoh1 transduction is specifically up-regulating Atoh1 gene regulatory networks that normally function in other Atoh1-expressing cell types.更确切地说,更可能的是,Atoh1激活了在胞囊支持细胞中恰好包含可接近靶点的基因的隐性表达。

支持细胞转化为毛细胞不仅涉及毛细胞基因的上调,但也必须对支持细胞基因进行下调。为了确定毛细胞杀死和培养后支持细胞基因下调的程度,and whether this down-regulation can be enhanced by Atoh1,我们在我们的RNA序列实验中分析了支持细胞富集基因的行为。我们制作了热图来观察2619个支持胞外支持细胞的基因在Ad-Td番茄或Ad-Td番茄-Atoh1病毒感染后杀死和培养毛细胞后的行为。在毛细胞杀死和培养后,数百个支持细胞的基因(608个在支持胞囊细胞中被显著下调。(图3-图补充2a),包括一些与分化有关的基因(Figure 3—figure supplement 2B).当胞外支持细胞感染AToH1病毒时,少量(107)额外的支持细胞基因被下调。(图3-图补充2a).Significantly,10天后,许多支持细胞基因仍在我们培养的胞囊中表达。基因本体分析表明,在支持细胞中仍有大量的基因表达与Go相关,如细胞粘附、细胞黏附、细胞黏附等。粘着和整合素结合(Figure 3—figure supplement 2B).

支持细胞对毛细胞死亡和ATOh1转导反应的单细胞RNA序列分析

我们的大量RNA序列分析显示,在用庆大霉素处理和培养10天后,支持胞浆的细胞集体上调许多毛细胞基因。此外,额外的毛细胞基因通过与ATOH1.为了确定我们的大量RNA序列数据在多大程度上代表支持细胞对这些条件的不同反应的平均值,we performed single cell RNA-seq analysis of purified supporting cells from utricles treated with gentamicin,感染Ad-Td番茄或Ad-Td番茄-Atoh1并培养10天(与中描述的相同方案图2H).为了深入了解单个细胞的转录反应,we used the MATQ-seq technique (Sheng等人,二千零一十七)这提供了比传统的单细胞RNA-seq协议更大的阅读深度和转录物的表示的优势。我们手动挑选,amplified and sequenced RNA from 34 individual tdTomato and 27 tdTomato-Atoh1 transduced supporting cells.We analyzed cells that had more than 1 million uniquely mapped reads,with each cell having around fifteen thousand genes identified.在这61个细胞中,34株td番茄和22株td番茄-atoh1转导的支持细胞通过了质量控制试验,并进一步进行了分析。

要将单个单元格分组为各自的单元格类型,利用T-分布随机邻域嵌入技术进行了基于图的聚类和可视化。下一步,all 56 individual transcriptomes were computationally analyzed and the results were visualized after T-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) dimensionality reduction (图4A).我们发现这两组受感染的细胞在转录空间中通常彼此分离得很好。(图4A).我们对56个细胞进行了无监督的层次聚类分析。(图4C)根据它们在我们对成熟胞囊毛细胞的初始体RNA序列分析中鉴定的前500个毛细胞特异性基因的表达。(图4C).尽管我们观察到毛细胞基因在单个细胞间的相对表达存在异质性,tdTomato-Atoh1 and tdTomato transduced supporting cells tended to cluster separately.在确定的四个子集群中,一个只含有ATOh1转导细胞(n=11个细胞;图4C,红细胞团)和两个细胞团中含有唯一的td番茄转导细胞(n=8细胞;图4C;深蓝色簇)或几乎所有的td番茄转导细胞(n=20 td番茄细胞和n=1 atoh1细胞;图4C,浅蓝色簇)。最后一个集群更加异构,含10个ATOh1细胞和6个TD番茄细胞(图4C,橙色星团)。许多先前确定的毛细胞基因在ATOh1转导细胞中的表达水平高于单纯的TD番茄,例如POU4F3,Gfi1,Tmc1,Lhx3,Pvalb,TomtMgAT5b,最大似然估计Rab15蔡等,二千零一十五图4BFigure 4—figure supplement 1).However,我们还发现了毛细胞基因的一个子集,在ATOh1-和TD番茄转导细胞之间没有显着差异(例如,Fscn2图4B,CFigure 4—figure supplement 1).

Figure 4含2种补充剂 看到一切
单细胞RNA序列分析显示支持细胞对毛细胞死亡和ATOh1转导反应的异质性。

) t-SNE analysis of single cells (n=56)对于Ad-Td番茄(n=34)和Ad-Td番茄-Atoh1(n=22),使用matlab感染支持细胞。(B) Box-plot for verified hair cell specific genes,包括未被Atoh1病毒感染(mcoln3,由atoh1病毒感染(chrna10,MgAT5b,MregRab15).APM:每百万个放大器的放大器。(C) Heatmap showed hierarchical clustering of gene expression level between each single cells (Ad-tdTomato-Atoh1 infected cells labeled in red,以及Ad-Td番茄感染的支持细胞,标记为蓝色)的前500个胞毛细胞富集基因。Color code on the left suggested clustered genes population while on the top showing how each cells clustered together.许多以前被鉴定的毛细胞基因也出现在热图中。

https://doi.org/10.7554/188bet体育电竞eLife.44328.012

随着支持细胞向毛细胞样细胞转化,毛细胞基因的上调可能伴随着支持细胞基因的下调。为了测试这一点,我们利用纯化的胞外支持细胞中的前500个支持细胞特异性基因的表达,对单个ATOh1和td番茄转导的支持细胞进行了第二次分级聚类。(图4-图补充2).果不其然,与仅接受td番茄病毒的支持细胞相比,用atoh1转导的支持细胞倾向于表达前500个支持细胞基因的较低水平。

胞外和耳蜗支持细胞再生能力的差异与毛细胞基因增强子染色质可及性相关

The adult utricle is able to undergo a limited amount of regeneration in response to hair cell loss,whereas this has not been observed in the adult cochlea (Forge et al.,一千九百九十三Ruell等人,一千九百九十五Kuntz和Osterle,一千九百九十八OgATA等,一千九百九十九Kawamoto等人,二千零九林等人,2011戈卢布等,二千零一十二).此外,我们的数据,再加上以往的研究,show that Atoh1 transduction is able to promote some degree of supporting cell trans-differentiation into hair cell-like cells in the adult utricle,但不是在成人耳蜗里(寿等,二千零三凯莉等人,二千零一十二刘等人,二千零一十二高等人,二千零一十六泰勒等人,二千零一十八).One explanation for these differences in regenerative capacity is that loci of hair cell genes may be more transcriptionally accessible in utricle supporting cells compared to their cochlear counterparts.为了测试这一点,我们用ATAC-seq来评价胞囊和耳蜗不同细胞群中毛细胞基因座的可及性。对于这个分析,我们研究了1912个在胞毛细胞中富集的基因。(Figure 1C).果不其然,ATAC-Seq鉴定了许多与转录起始位点(TSS)相对应的近端元件和毛细胞基因座中的远端元件的例子,这些元件在毛细胞中是可获得的,但不支持细胞。(图5A),支持细胞基因座在支持细胞而非毛细胞中可获得。(图5B).However,我们还观察到可获取的DNA的存在,表明染色质相对开放,在转录起始点附近,胞囊支持细胞毛细胞基因座的基因间区和内含子(图5C图5-图补充1a,b),提示成人胞外支持细胞维持一些毛细胞基因座在转录可获得状态。However,然而,这些毛细胞基因座在支持细胞中的表达水平比毛细胞低1-2个数量级。如图所示。Figure 5—figure supplement 2此外,耳蜗(r 0.04)或支持细胞(r 0.02)毛细胞基因的表达水平与其相对染色质可及性之间没有相关性。(图5-图补充3a,b).

图5含3种补充剂 看到一切
ATAC-seq分析表明,毛细胞基因座在支持胞囊细胞中比耳蜗支持细胞更容易获得。

)毛细胞特异性基因的ATAC序列图示例,LHFPL5,不在支持细胞中表达的。在毛细胞样本中出现峰值,但不是支持细胞样本B)支持细胞特异性基因的ATAC序列图示例,SOX10,不在毛细胞中表达。Peaks are present in the supporting cell sample,但不是毛细胞样本。(C)毛细胞特异性基因的ATAC序列图示例,ChRN10不在支持细胞中表达的。A similar distribution of peaks is observed in utricle hair cells and supporting cells,but the peaks are absent in P21 cochlear supporting cells.(D)热图显示了胞毛细胞ATAC-Seq信号的相关性,supporting cells and P21 cochlear supporting cells.峰值根据其与转录起始位点(TSS)的接近程度进行分组,或者如果位于距离注释的TSS>2 kb的地方,则按照发生在远端增强剂中的峰值进行分组。顶部,假定的毛细胞基因启动子(n=1549)的ATAC序列信号(读取深度)。高读取强度以橙色显示。底部,ATAC序列信号(读取深度)在更远端的毛细胞基因增强器(n=464)。高读取强度显示为蓝色。

https://doi.org/10.7554/188bet体育电竞eLife.44328.015

接下来,我们将来自支持胞囊细胞的ATAC-seq数据与从细胞中纯化的3周龄耳蜗支持细胞的相似分析进行了比较。绿色荧光蛋白transgenic mice that exclusively label supporting cells in the mature cochlea (马斯等人,二千零一十六).我们将我们的研究重点放在428个基因上,RNA序列分析显示这些基因在胞囊和耳蜗毛细胞中都有表达。比较TSS周围的ATAC序列峰,这些常见毛细胞基因的基因间区和内含子-例如,the hair cell geneChRN10-与耳蜗支持细胞相比,成人支持细胞的开放峰更多。(图5D).Heat maps of all ATAC-seq peaks called for the common hair cell genes observed in mature utricle hair cells,胞囊支持细胞和成熟的耳蜗支持细胞如图5D.我们发现在所有三种细胞类型中,转录起始位点附近的许多毛细胞峰都是相似的。However,when we analyzed ATAC-seq peaks in distal regions more typically associated with enhancers,我们发现在成熟的胞毛细胞和支持细胞中可获得的峰在成熟的耳蜗支持细胞中相对不易获得。(图5DFigure 5—figure supplement 1C,D).这表明,不同染色质的可及性可能是解释为什么成熟的耳蜗支持细胞在表达atoh1后不能进行自发再生或反分化的原因之一。

尽管我们证明,在庆大霉素存在下培养后,许多毛细胞基因可以在胞囊支持细胞中被激活,而且ATOh1的转导可以上调额外的毛细胞基因,we nevertheless observed that almost 1000 utricle hair cell genes were not significantly up-regulated in supporting cells in either condition (图3B,C图6-图补充1a、b).与能够上调的基因相比,这些基因座上的染色质在支持胞囊的细胞中可能更不容易获得。为了测试这一点,我们分析了我们的ATAC-seq数据,比较了毛细胞杀死后,支持细胞中可以上调的毛细胞基因之间染色质的可及性。或在毛细胞杀伤和ATOh1转导(945个基因)后,与在这些条件下不能上调的毛细胞基因相比(967个基因;图6-图补充1a).我们观察到在TSS周围的支持细胞染色质可及性没有显著差异。与未上调的967个毛细胞基因相比,945个上调毛细胞基因的基因间区或内含子。(图6A图6-图补充1b).这些数据表明,相对染色质的可及性不太可能是决定毛细胞基因在细胞死亡或ATOh1转导后能否在胞外支持细胞中被激活的重要因素。更确切地说,可能这些基因不是由AToH1直接调控的,或者除了ATOh1外,其他转录因子也需要诱导。

图6含4种补充剂 看到一切
胞外支持细胞中的atoh1过度表达可重塑毛细胞基因座的染色质。

)聚集图显示了来自每个条件的ATAC序列信号的富集,这些信号具有独特的胞果峰,这些胞果峰被分配给945个毛细胞基因,这些毛细胞基因可以在支持细胞(左侧)中被诱导,或者967个毛细胞基因不能在支持细胞(右侧)中被诱导。这两组毛细胞基因的相对可及性没有显著差异。(B) Example of an ATAC-seq profile for a hair cell-specific gene,可通过ATOh1转导改变的RASD2。RNA序列分析表明,RASD2在支持细胞中通过ATOh1转导上调。但不适用于TD番茄控制病毒。一个独特的ATAC序列峰存在于毛细胞中,但不支持细胞(黄色突出)。However,the peak re-appears in supporting cells transduced with Atoh1,但不适用于TD番茄控制病毒。与此峰相对应的DNA序列显示了ATOh1与其他转录因子的结合位点。(C)毛细胞特异性基因的ATAC序列图示例,KCNJ13。RNA序列分析表明,KCNJ13在支持细胞中不通过ATOh1或td番茄控制病毒的转导而上调。Nevertheless,一个独特的ATAC-seq峰存在于毛细胞中,在用ATOh1转导的支持细胞中被重新打开。

网址:https://doi.org/10.75188bet体育电竞54/elife.44328.019

在毛细胞分化后不久,ATOh1通常下调。(谢兰等,一千九百九十九Driver et al.,二千零一十三蔡等,二千零一十五马斯等人,二千零一十五)因此不太可能调节成熟毛细胞中的毛细胞基因。我们通过从头开始的基序分析,分析了不同年龄的耳蜗毛细胞和支持细胞的ATAC-seq峰,以确定每种细胞类型的ATAC-seq峰中AToh1结合序列的表达。(图6-图补充2).果不其然,而其他已知的毛细胞特异性转录因子结合基序,包括pou4f3和ctcf,在成人胞囊毛细胞的ATAC-Seq峰高度富集,ATOh1结合基序在成人胞囊毛细胞或支持细胞的ATAC-seq峰中没有显著丰富(p值分别为=1.00e-9和p值=1;图6-图补充2图6-源数据1).In contrast,AToh1基序在新生儿耳蜗毛细胞的ATaC-seq峰高度富集,其中AToh1仍在表达(p值=1.00e-1040;图6-图补充2c;和图6-源数据1).这些结果表明,ATOh1结合位点在发育中的毛细胞中是可用的,但在毛细胞成熟过程中变得不易接近。

Atoh1 overexpression changes the epigenetic landscape of utricle supporting cells

除了调节转录外,在某些情况下,bhlh基因被认为是先驱因子,它们可以与染色质静止区域的核小体结合,增加染色质的可及性。(苏菲等,二千零一十五).It is therefore possible that when Atoh1 is expressed in mature supporting cells,它可以结合静止的毛细胞位点,使它们更容易转录。我们能够在ATAC序列分析中找到这种行为的例子。例如,毛细胞特异性基因,RASD2在胞果毛细胞中含有一个很强的ATAC-Seq峰,但胞囊支持细胞中不存在峰值。(图6B).However,用Ad-Td番茄-Atoh1而不是Ad-Td番茄转导支持细胞,使得该区域与毛细胞具有可比性。(图6B).对与这一峰相对应的DNA区域的分析证实存在一个AToH1结合位点。(图6B),以及pou的结合位点,TCF和ASCL转录因子,以及TGFβ超家族信号的Smad传感器的结合位点。Motif分析显示其他毛细胞转录因子的结合位点,包括TCF12,也富含由Ad-td番茄-atoh1病毒转导产生的峰。(图6-图补充2c).为了观察这种现象是否扩展到其他基因座,我们对已被外源性转导的胞外支持细胞中的ATAC序列峰进行了从头开始的基序分析。ATOH1,以番茄转化细胞作为对照。我们观察到Atoh1结合基序在Ad-Tdtocato-Atoh1感染细胞的开放区域富集(p值=1.00e-107;图6-图补充2c图6-源数据1),but not in Ad-tdTomato infected cells (p value = 1;图6-图补充2c图6-源数据1).

一起,这些结果表明,支持细胞中ATOh1的激活可以直接或间接地重新编程胞外支持细胞的表观遗传景观,使一些毛细胞基因座更容易获得。However,给定基因周围染色质的可及性增加并不一定意味着基因将被转录。头发细胞基因就是一个例子。Kcnj13,其中,支持细胞的AToH1转导恢复了在毛细胞中发现的ATAC-Seq峰,但不能激活转导支持细胞中基因的转录。(图6C).此外,we saw no changes in expression of the three genes (GYYF2Efhd1NEGF) located within ±200 kb ofKcnj13.When we compared ATAC-seq peaks unique to hair cells between induced and uninduced hair cell genes,we found about ten percent of those peaks became accessible in supporting cells after Atoh1 transduction in each group (Figure 6—figure supplement 3A).这表明ATOh1能够引起毛细胞基因座周围染色质的开放。但这种开放并不一定会导致这些基因的转录,提示激活给定基因的转录可能需要额外的转录因子。Furthermore,我们观察到ATOh1转导也导致了数百个不存在于胞毛细胞中的峰的开放。(图6-图补充4a,b).这就增加了一种可能性,即由ATOh1诱导的一些基因可能被ATOh1结合的秘密结合位点激活。

讨论

成年小鼠前庭支持细胞的毛细胞转化率非常低。(Bucks et al.,二千零一十七)对ATOh1转导无明显反应。(高等人,二千零一十六).In contrast,氨基糖苷杀死毛细胞,延长细胞培养或基因消融术策略似乎是主要的成人前庭支持细胞向上调节一些毛细胞基因并产生毛细胞样细胞。(戈卢布等,二千零一十二Bucks et al.,二千零一十七),这种毛细胞的产生可以通过诸如ATOh1转导或Notch抑制等干预来增强。(寿等,二千零三戈卢布等,二千零一十二高等人,二千零一十六泰勒等人,二千零一十八).在本研究中,we used a low dose of gentamicin applied for 24 hr that was sufficient to kill significant numbers of hair cells,but maintained supporting cells in a normal morphological state.与毛细胞损伤允许支持细胞采用更易于转化为毛细胞的细胞状态的观点一致,we observed significant transcriptional changes in utricle supporting cells over a ten day period.However,这些细胞没有显示出任何明显的毛细胞形态特征,它们也没有上调毛细胞的典型标志物,如肌球蛋白7a。ATOh1的腺病毒转导需要诱导数百个额外的毛细胞基因的表达。(图3B).目前尚不清楚毛细胞死亡后,支持细胞的“启动”状态是否会持续很长时间,或者是对伤害的急性反应。Although our culture system is not suitable to answer such questions,将体内的毛细胞杀伤模型与转基因的Atoh1活化方法相结合,来测量成熟的支持胞体的细胞在损伤和毛细胞丢失后保持再生能力的时间,这将是有意义的。

在毛细胞死亡或ATOh1转导后,胞囊中毛细胞基因的诱导与成熟耳蜗在损伤后不能生成毛细胞样细胞形成形成形成鲜明对比。ATOh1不能促进成熟耳蜗支持细胞的转化分化(凯莉等人,二千零一十二刘等人,二千零一十二).我们的ATAC-Seq实验表明,耳蜗和胞囊共同的毛细胞基因座周围的染色质在胞囊支持细胞中比耳蜗对应细胞更容易获得。这可能是它们更高再生能力的基础。目前,我们不知道胞外支持细胞中的毛细胞基因座如何比耳蜗支持细胞保持更宽松的状态。关于鸡和斑马鱼的研究,表现出自发的毛细胞再生,已经证明参与组蛋白重塑的基因是支持细胞增殖的重要调节因子。鸟类中,HDAC对前庭上皮再生的抑制导致支持细胞增殖减少。(Slattery等人,二千零九).类似于斑马鱼,HDAC抑制导致支持细胞增殖的侧线减少,从而导致毛细胞再生。(他等,二千零一十四他等,二千零一十六).抑制赖氨酸特异性去甲基酶1(LSD1,斑马鱼也被称为kdm1a)也可以防止支持细胞增殖。(汤等,二千零一十六).最后,最近的一项研究表明,bmi1,多梳抑制复合物1(prc1)的一部分,通过维持高水平的正常Wnt信号来支持新生小鼠的细胞增殖。(陆等,二千零一十七).不管胞囊和耳蜗支持细胞染色质可及性差异的机制基础如何,我们认为,这可能有助于成熟动物中这两种哺乳动物感觉器官之间的再生差异。

尽管有大量的毛细胞基因可以在成熟的胞囊支持细胞中被激活,然而,我们观察到近1000个胞毛细胞基因在支持细胞中没有上调。甚至在杀死毛细胞和ATOh1转导之后。其中许多基因与毛细胞功能的成熟有关,包括发束和扭结的发育。A recent study in which human utricle tissue was transduced with an Atoh1 adenovirus also reported phenotypes consistent with incomplete hair cell differentiation,包括缺乏立体纤毛和肌动蛋白捆绑蛋白,如ESpin,没有表皮板和带状突触(泰勒等人,二千零一十八).ATOh1转导后支持细胞向毛细胞的不完全转分化的原因是什么?一种可能是我们10天的培养和ATOh1重编程时间不足以完全上调最成熟的毛细胞基因。通过转录因子对细胞重编程的研究表明,单细胞水平的重编程事件最初是以随机方式进行的,然后最终进入完全重编程状态。(汉娜等人,二千零九BuGaIM等,二千零一十二卢扬等人,二千零一十五).我们的单细胞分析(Figure 4),以及最近单细胞分析耳蜗中的ATOh1激活(Yamashita等人,二千零一十八),show a wide degree of heterogeneity in transcriptional responses to Atoh1 transduction that may underlie this incomplete transformation to hair cells.或者,since Atoh1 is normally down-regulated as hair cells differentiate (谢兰等,一千九百九十九Driver et al.,二千零一十三蔡等,二千零一十五马斯等人,二千零一十五),在腺病毒感染后持续表达ATOh1可能会积极抑制与毛细胞成熟相关的基因,这些基因通常会随着ATOh1水平的下降而被激活。第三种可能性是一些毛细胞基因完全独立于ATOh1调节,不受ATOh1表达的影响。或者,some hair cell genes may require additional transcription factors or co-activators for expression (for example,Gfi1 and Pou4f3;科斯塔和亨里克,二千零一十五科斯塔等,二千零一十五),这些并不是由ATOh1单独表达上调的。最后,it is possible that the chromatin of some genes associated with hair cell maturation are less transcriptionally accessible in supporting cells than other genes associated with earlier steps in hair cell development.当我们研究支持细胞基因对毛细胞杀伤和ATOh1转导的反应时,我们还发现,尽管培养10天和ATOh1表达,许多基因仍在胞囊支持细胞中表达。上述原因也可能是这些基因在这些条件下持续表达的原因。支持细胞中表达的一些基因也可能直接或间接地阻止ATOh1进入其目标基因座,这些基因也可能构成治疗靶点。

本研究进行的表观遗传学和转录组学分析表明,ATOh1不足以诱导支持细胞中许多毛细胞基因的表达。即使他们的染色质是可接近的。我们对AToH1转导的支持细胞的ATAC序列分析表明,特定毛细胞位点的染色质可及性并不一定与该位点在胞外支持细胞中被AToH1转录激活的能力相关。我们比较了可上调的毛细胞基因(945个基因)与未激活的毛细胞基因(967个基因)在支持细胞中的染色质可及性。(图6-图补充1a)但在转录起始位点或增强子区域的可及性方面没有发现显著差异。(图6-图补充1b).此外,尽管我们提供了一些例子,其中ATOh1转导可以直接或间接地使某些毛细胞位点在转导到支持细胞时更容易获得。(图6B),我们发现在特定的毛细胞基因位点上打开染色质对ATOh1的反应与在支持细胞中激活该位点转录对ATOh1的反应没有关系。(图6).相反,对Atoh1打开的染色质峰的从头序分析表明,与不能单独由Atoh1诱导的基因座相比,Atoh1诱导的基因座的峰中富含不同的转录因子结合位点。(图6-图补充3b).

因此,我们的数据表明染色质的可及性并不能很好地预测胞外支持细胞中的atoh1是否诱导毛细胞基因。更确切地说,我们认为,尽管atoh1可能足以诱导一些毛细胞基因的表达,可能需要额外的转录因子或染色质重塑物来诱导支持细胞中完整的毛细胞基因补体。许多转录因子被认为在毛细胞诱导过程中与ATOh1协同作用。如GFI1,POU4F3,ISL1GATA3和Wnt信号通路的靶点(科斯塔和亨里克,二千零一十五科斯塔等,二千零一十五Kuo等人,二千零一十五Walters et al.,二千零一十七Yamashita等人,二千零一十八).这些转录因子的系统组合测试,在一个更好的定义毛细胞基因调节网络的背景下,将需要确定毛细胞转录因子的最佳混合物,为毛细胞命运的最佳重新编程所需。

材料和方法

动物

ATOH1-CRERT2(MGI: Tg(Atoh1-cre/Esr1*)14Fsh) (Machold和Fishell,二千零五)和ai3(mgi:gt(rosa)26sortm3(CAG-EYFP)Hze/J)麦迪逊等人,二千零一十) transgenic lines were obtained from Jackson Laboratories (stock numbers 007684 and 007903).ATOH1A1GFP/A1GFP(MGI:ATOH1)TM4.1HZO;杰克逊实验室的库存编号为013593)小鼠的产生如前所述。(Rose et al.,二千零九) and obtained from Dr.Huda Zoghbi贝勒医学院。GFI1-CRE(MGI:GFI1)TM1(Cre)GaN)如前所述产生小鼠。(杨等人,二千零一十) and obtained from Dr.Lin Gan罗切斯特大学。绿色荧光蛋白(mgi:tg(lfng egfp)hm340gsat)由gensat项目生成。(Geschwind二千零四海因茨二千零四施密特等人,二千零一十三).ICR mice were used for utricle viral infection and culture.除非另有说明,男性和女性在4周至8周之间使用。To label adult utricle hair cells,ATOH1-CRERT2GFI1-CRE男性与AI3纯合子女性杂交。将三苯氧胺以10 mg/ml的浓度溶解于花生油中;三剂75–100 mg/kg的药物在10岁时皮下注射到出生后的幼犬体内,12,以及14天的年龄。贝勒医学院动物护理和使用委员会批准了所有动物实验。

胞浆培养和腺病毒感染

用腺病毒载体对腺病毒5型(AD5)进行基因工程。(沟口和凯,一千九百九十八)在EF1a启动子(picpis-ef1)的控制下单独驱动TD番茄或ATOh1侧翼有一个t2a序列。addgene目录号73355)。如前所述,从成年ICR小鼠中分离出胞外植体。(布兰登等人,二千零一十二).解剖后,胞果在含有氮气的DMEM-F12中的聚碳酸酯膜(SPI供应)上培养。青霉素和杀菌剂。所有培养物均保持在5%的CO中。2加湿培养箱。庆大霉素治疗,培养物保持在0.1μm,0.5μm,1μm或2μm庆大霉素培养基24小时。对于病毒感染,用含5×10的25μL培养基代替含庆大霉素的培养基。viral particles one day later.将胞外植体在37℃的病毒溶液中培养1小时。病毒孵化一小时后,将175微升无血清培养基添加到每个孔中,并在一天后用含5%FBS的DMEM-F12替换含病毒培养基。胞果再培养1-9天,每隔一天用新鲜培养基替换一半培养基。对于所有的实验,three biological replicates (i.e.同时测量不同生物样本)。

半胱天冬酶活性检测

检测半胱天冬酶活性,在0.1 mm庆大霉素存在或不存在的情况下培养胞果24小时。去除含有庆大霉素的培养基后,50微升nucview488 caspase-3底物(岑等,二千零八;生物股份有限公司USA) was added to the explants to give a final concentration of 5 µM for 30 min.然后在37℃下用PBS洗涤胞果三次,每次10分钟。固定并进行免疫组化处理。

免疫组化

For utricle staining,explants were fixed in 4% paraformaldehyde for one hour and washed with PBS containing 0.1% TritonX-100.本研究使用的主要抗体是抗moysin7a(1:500,兔;变形杆菌属)抗SOx2(1:500,兔;微孔)反RFP(1:500,兔;微孔)抗gfp(1:500,鸡肉;abcam)和anti-cd326(1:200;大鼠;热渔夫;目录号17-5791-82)。使用的二级抗体是Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 594(1:2000,Invitrogen).用0.5ug/ml磷酸二铵在PBS中孵育20分钟,标记细胞核。免疫荧光图像在蔡司AXIOIMAGER显微镜上,载玻片结构光照。

Western blotting

本研究中使用的主要抗体是抗RFP(1:5000,兔;微孔)抗AToH1(1:50000,鸡肉;马修·凯利和托马斯·科特的礼物;Driver et al.,二千零一十三)以及抗GAPDH(1:5000,鸡肉;Millipore)实验在标准Western方案下进行,采用Amersham ECL Western blotting检测(GE Healthcare)。图像由LAS-4000微型发光图像分析仪采集。

用FACS纯化细胞

从p1解剖耳蜗ATOH1A1GFP/A1GFP或P21绿色荧光蛋白分别收集新生毛细胞或成体支持细胞的小鼠。收集成人胞果毛细胞,胞囊从ATOH1-CRERT2;Ai3 mice after treated with tamoxifen as described above.收集成体胞囊支持细胞,胞囊从GFI1 CIER;AI3小鼠。分离出的耳蜗或胞囊,然后用木瓜蛋白酶分离系统(沃辛顿生化公司)分离。Briefly,用不含钙和镁的PBS清洗组织,然后在37°C的木瓜蛋白酶溶液中培养50分钟,摇动200转/分。去除木瓜蛋白酶溶液,用2%FBS冲洗CMF-PBS中的组织。然后在含有2%FBS的CMF-PBS中用1000μL移液管尖端将组织轻轻研磨100–150次,以生成单细胞悬浮液。用于分离成人胞囊支持细胞,分离后的细胞在4°C条件下,用抗CD326结合异藻蓝蛋白(APC)染色20分钟,然后进行分类。Cells were purified on a BD FACS Aria cell-sorting flow cytometer using a 100 µm nozzle.对于RNA SEQ,大约2000个细胞被分类并直接收集到裂解缓冲液中。对于ATAC SEQ,在DMEM+10%FBS中对约5000个细胞进行分类和收集。对于单细胞RNA序列,以TD番茄荧光为基础对活细胞进行分类,在荧光显微镜下人工提取单个细胞,并加入溶解缓冲液。

qPCR

按照制造商的说明,使用Arcturus Picopure RNA分离试剂盒(应用生物系统)从分类细胞中提取总RNA。cDNA是使用qscript cDNA supermix(quantabio)生成的。采用主SYBR绿色试剂盒(应用生物系统)在一步一加实时PCR系统(应用生物系统)上进行定量PCR(qpcr)。相对量化(2-ddCT)以家政基因GAPDH为内控,对基因表达进行分析。用于qpcr的基因特异性引物有:tdtomato-f(cct-gtt-cct-ggg-gca-tgg)和tdtomato-r(tga-tga-cgg-cca-tgtt-tgg);ATOh1-F(ATG CAC GGG CTG AAC CA)和ATOh1-R(TCG TTG TTG AAG GAC GGG ATA);肌球蛋白6-F(TGT TAA GGC AGG TTC CTT GAA G)和肌球蛋白6-R(ACA CCA GCT ACA ACT CGA AAC);肌球蛋白7-F(a gg-ggg-act-atg-tat-gg a-tgga)和肌球蛋白7-R(atg-tgc-gtg-gca-ttc-tga-gg);GAPDH-F(AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG)和GAPDH-R(TGT AGA CCA TGT AGT TGA GGT CA)。

RNA-seq

大约2000个facs排序的细胞被用作RNA序列的输入。使用smart seq v4超低输入RNA试剂盒提取RNA。用安捷伦生物分析仪和Nextera-XT DNA文库制备试剂盒制备的DNA文库对提取和扩增的cDNA进行测定。Paired-end (75 × 75 bp) sequencing was performed on an Illumina Nextseq500 instrument.使用的生物复制品数量为:胞外毛细胞(2)胞果支持细胞(3)番茄感染胞果(3)Atoh1-Td番茄感染胞果(2)耳蜗支持细胞(2)。每个样本的测序深度约为3000万次。序列数据已按照登记代码GSE122732和GSE121610存放在GEO中。

RNA序列分析

RNA序列数据集上传到Galaxy Web平台进行数据分析。(阿甘等,二千零一十六).Briefly,使用hisat2将处理后的成对末端读取映射到小鼠参考基因组(mm10)。通过HTSEQ计数计算读取计数,并使用DESEQ2包识别差异表达基因。用Benjamini-Hochberg校正法计算DESEQ2包中的调整后P值。倍数变化大于4倍且调整后p值小于1×10的基因- 5被认为是重要的。通过直接比较每种细胞类型的RNA序列读数,计算胞毛细胞和支持细胞中丰富的转录物的鉴定。通过比较胞外支持细胞和Ad-Td番茄细胞的RNA序列来鉴定富含Ad-Td番茄感染细胞的转录产物。同样地,比较胞囊支持细胞和Ad-Td番茄-Atoh1感染细胞的RNA序列,鉴定富含Ad-Td番茄-Atoh1的转录物。对于RNA序列数据的主成分分析,将各组的标准化计数用作clustvis中的输入数据。输入数据采用帕累托标度法和奇异值插补分解法进行预处理。大卫网络工具(黄等人,2009b黄等人,2009年A)用于识别强化的go术语。

单细胞Matq序列

在培养基中对Ad-Td番茄或Ad-Td番茄-Atoh1感染的支持细胞进行Fac分类。将单个细胞单独提取到96孔的PCR板上(Bio-Rad cat.不。HSS9601),含有1μl Matq Seq分解缓冲液(0.65μl,0.3%Triton-x100超纯水)(Thermo Fisher Scientific,Cat.不。750024)0.2 μL of MATQ-seq primer mix (Sheng等人,二千零一十七),0.05μl的dntp(neb,Cat.不。N0447S),0.1米DTT 0.05μL,和0.05μl RNaseout(Thermo Fisher Scientific,Cat.不。10777019)和10μl的PCR级矿物油(Sigma cat.不。M8662)防止蒸发。Matq Seq在Bravo自动液体处理平台(Agilent)上执行。The lysis plate was then briefly centrifuged.如前所述进行逆转录。(Sheng等人,二千零一十七).为了区分这两条线,second strand synthesis was performed with a primer containing three mismatches to the first strand primer at the 3' end.然后用1.2X Ampure xp珠(Beckman Coulter,Cat.不。A638 80)。

制造双链cDNA,20 ng of PCR product was diluted into 10μLof PCR grade water in each well of a 96-well plate and heated at 95°C for 30 s to melt the DNA.要进行反应,含2μl 10x热溶胶缓冲液的10μl酶混合物,0.6μl 10μm条形码底漆,0.5μl 10毫米DNTPS,0.3 μL Deepvent exo-DNA polymerase (NEB,Cat.不。M0259S),在每个样品中加入6.6μl的PCR级水。条形码引物包含特定于第一链引物的序列和与Illumina序列器兼容的P7序列。在60℃进行20 s和72℃进行30 s的20个循环,以将条形码底漆添加到第一股。5 μL of 50 mM EDTA was then added to each well to terminate the reaction.然后将样本汇集在一起,用1X Ampure XP珠子纯化。然后使用nextera DNA文库准备试剂盒(Illumina,Cat.不。FC-121—1030)。然后利用制造商提供的nextera p5引物和p7引物对文库进行扩增,只选择第一条链上具有唯一分子标识符(umi)的扩增子。双相特异性核酸酶(Evrogen,Cat.不。EA003)对100 ng文库进行治疗,去除核糖体cDNA,如前所述。(Sheng等人,二千零一十七).样本在nextseq500光源上进行测序。序列数据已按照登记号GSE127683存放在地理位置。

Single cell MATQ-seq analysis

对于单细胞数据分析,九个碱基从第二个读数中进行修剪,以去除振幅指数碱基。使用星型定位仪对小鼠基因组(mm10)进行配对端定位。Gencode annotation release M10 (GRCm38.p4) was used for transcript annotation.Only reads with mapping quality over 250 were used for downstream analysis.条形码检索,唯一条形码计数,基因表达的量化如前所述。(Sheng等人,二千零一十七).读取的映射位置作为相应条形码标识的一部分。Only reads mapped to the exon region with correct strandness were used for gene expression quantification.使用Matlab生成TSNE图。利用matlab中的clustergram函数生成热图。

阿塔克SEQ

大约5000个facs排序的细胞被用作ATAC的输入。ATAC是根据科尔斯等人。(2016).Briefly,分类的细胞被旋转下来,FACS buffer was removed,将颗粒重新悬浮在含有转座酶的反应混合物中,在37°C下进行标记前加入0.05%地高辛,搅拌1000转/分30分钟。下一步,用qigen-pcr-mineute试剂盒(qigen 28004)纯化转座子DNA。在PCR扩增后,用Ampure XP(Beckman Coulter)珠纯化1.8x SPR纯化快速ATAC文库。Paired-end (75 × 75 bp) sequencing was performed on an Illumina Nextseq500 instrument.使用的生物复制品数量为:胞外毛细胞(3)胞果支持细胞(3)番茄感染胞果(3)Atoh1-Td番茄感染胞果(2)耳蜗支持细胞(2)。每个样本的测序深度约为3000万次。序列数据已按照登记代码GSE121610存放在GEO中。

ATAC分析

ATAC序列读取被映射到小鼠基因组(mm10)使用bowtie2与默认配对结束设置。所有非核读取和未映射的成对读取都被丢弃。重复读取被picard markduplicates函数删除,using default settings.对合并的BAM文件使用macs2进行了峰值调用分析。macs2 callpeak——nomodel——广泛。由mm9编码识别的黑名单区域被提升到mm10,然后用bedtools减法模块从综合峰值文件中删除。使用bedtools对综合峰值文件中的每个条件进行读取计数。使用annotatepeaks.pl(homer)执行峰值注释。注释编译的峰值文件用于识别哪些基因包含可访问的峰值。对于每个条件之间的峰值可访问性比较,我们分离出了分配给特定基因组的所谓峰。我们将所有距离注释的TSS大于2 kb的峰都指定为增强剂。然后,我们使用床上工具确定了各组之间的独特和重叠峰。使用annotatepeak.pl(homer)执行聚合图。分析前对样品进行了两次正火。将样本的读取长度调整为40 bp,然后根据一组常见的高度可访问区域(即每个样品的前1000个峰中约有100个峰)。使用DESEQ2R包,以多V文件作为输入,进行PCA和差分可访问性分析。使用cqn r包执行条件分位数规范化。用荷马进行母题充实分析和个体状态峰值呼叫。ATAC SEQ信号热图是在HOMER中生成的,并使用Java TeeVIEW可视化。利用homer软件实现了UCSC浏览器快速ATAC信号可视化的床位图生成。所有的读取都被读取计数归一化了,其中,分数表示每bp每1×10的读取计数。阅读。

增强子基序分析

MEME suite 5.0.1 was used for de novo motif discovery and motif analysis of Atoh1 targets.增强器区域作为输入文件从UCSD浏览器中提取。ATOh1结合基序作为基序输入从Jaspar数据库中提取。FIMO(查找单个基序的出现)用于识别输入序列中ATOh1基序的出现。随后,MEME was used to discover reoccurrence motifs in candidate enhancer regions and Tomtom application was used to match identified motifs to known motifs.

工具书类

  1. 1
  2. 2
  3. 成年小鼠胞囊腺病毒介导的支持细胞感染的解剖
    1. CS布兰登
    2. C沃克尔·约翰逊
    3. 拉梅
    4. L坎宁安
    (2012)
    可视化实验杂志,103.91/1/334,22491073.
  4. 11
  5. 十二
  6. 十三
  7. 十四
  8. 十五
  9. 16
  10. 十七
  11. 十八
  12. 19
  13. 二十
  14. 二十一
  15. 二十二
  16. 二十三
  17. 二十四
  18. 二十五
  19. 二十六
  20. 27
  21. 28
  22. 二十九
  23. 三十
  24. 31
  25. 三十二
  26. 三十三
  27. 34
  28. 三十五
  29. 三十六
  30. 三十七
  31. 三十八
  32. 三十九
  33. 四十
  34. 四十一
  35. 42
  36. 四十三
  37. 四十四
  38. 45
  39. 四十六
  40. 四十七
  41. 48
  42. 四十九
  43. 五十
  44. 五十一
  45. 五十二
  46. 五十三
    Analysis of small hair bundles in the utricles of mature guinea pigs
    1. 朗伯
    2. 顾谷
    3. 科特温
    (1997)
    美国耳科学杂志 十八:637—643。
  47. 五十四
  48. 55
  49. 五十六
  50. 57
  51. 58
  52. 59
  53. 60
  54. 六十一
  55. 六十二
  56. 63
  57. 64
  58. 六十五
  59. 六十六
  60. 六十七
  61. 六十八
  62. 六十九
  63. 七十
  64. 七十一
  65. 七十二
  66. 七十三
  67. 七十四
  68. 七十五
  69. 76
  70. 77
  71. 七十八
  72. 七十九
  73. 八十
  74. 八十一
  75. 八十二
  76. 83
  77. 八十四
  78. 八十五
  79. 八十六
  80. 八十七
  81. 八十八
  82. 八十九
  83. 九十
  84. 九十一
  85. 92
  86. 93
  87. 九十四
  88. 九十五
  89. 九十六
  90. 九十七
  91. 九十八
  92. 九十九
  93. 100
  94. 101
  95. 102
  96. 一百零三

判决书

  1. 迪迪尔·斯泰尼尔
    高级编辑;马克斯普朗克心肺研究所,德国
  2. 弗朗索瓦·吉尔莫
    审查编辑;弗朗西斯·克里克研究所,大不列颠联合王国
  3. Donna Fekete
    审稿人

为了提高透明度,188bet体育电竞eLife includes the editorial decision letter and accompanying author responses.A lightly edited version of the letter sent to the authors after peer review is shown,表示最实质性的关切;通常不包括次要评论。

感谢您提交您的文章“Atoh1对小鼠胞囊毛细胞再生及其增强的转录和表观遗传调控”,供以下人员考虑:188bet体育电竞.你的文章已由高级编辑迪迪尔·斯泰尼尔审阅,弗朗索瓦·吉尔莫特作为评论编辑,and three reviewers.

The reviewers have discussed the reviews with each other and the Reviewing Editor has drafted this decision to help you prepare a revised submission.

总结:

本研究探讨转录因子ATOh1将受损小鼠前庭细胞重编程为毛细胞的能力。作者利用RNA-seq和ATAC-seq分析表明,ATOh1不能诱导大量毛细胞特异性基因的转录。包括打开染色质的基因,这表明缺乏必要的共同监管机构进行有效的修复。

裁判员一致认为这是一个及时的,精心构思和执行的研究,其结论主要由数据支持。However,审稿人已经确定了几个需要在出版前解决的问题。这需要对数据和文本中的更改进行新的分析,但很少或没有新的分析。

基本修订:

1)作者使用两种不同的基因标记策略从胞果中分离头发和支持细胞,用于图1所示的差异表达分析。这些细胞群的纯度是不确定的。从荧光素胞浆中分离出的gfp+细胞的比例是多少?AI3小鼠被支持细胞污染,有多少GFP-CD326+细胞被毛细胞污染?This information is necessary to rigorously evaluate the sensitivity and specificity of the approach.

2)在有和没有0.1 mm庆大霉素的情况下培养24小时的胞外植体中的毛细胞丢失数量应予以量化。

3)应报告表达myo7a的Ad-atoh1-td番茄转化的支持细胞总数。而不仅仅是记录如图2f所示的双标签单元格的百分比。

4)令人惊讶的是,与Ad-Tom感染细胞(图2c)相比,Ad-Atoh1中观察到的Atoh1蛋白水平的大幅度增加并不是由Atoh1 mRNA的类似倍数增加所表示的(图2i)。什么可以解释这种差异?

5)作者主要关注在USCS中激活的uhc基因,以响应损伤和AToH1转导(图3)。这也将有助于描述如下的USC基因集:而不是,受到损伤和ad-atoh1转导的抑制,因为它们也可能代表了对HC转化的重要障碍。其中一些数据报告用于图4-图补充2中的单细胞分析,但从大量RNA序列数据中进行更详细的鉴定是值得的,突出感兴趣的候选基因。

6)图3b和图c中的数据表明,一些参与立体纤毛束形成的基因在对ad-atoh1感染的反应中被上调。Authors should comment on whether HC like-cells exhibit morphological features of uHCs and provide supporting evidence.

7)“胞外和耳蜗支持细胞再生能力的差异与毛细胞基因启动子染色质可及性相关”小节中提到的428个常见毛细胞基因在USC和CSC中是否显示接近零的表达?If not,USC和CSC在启动子和这些基因的远端元件上的染色质可及性差异可能反映了mRNA表达水平的差异。两种细胞类型的ATAC-seq和RNA-seq数据集之间应进行相关性分析。

9)USCS中的开放染色质环境是否特定于UHC基因?

10)图6中的结果突出了在受损的USCS中异位表达ATOh1会在可能或不可能与附近基因的基因激活相关的超高温特异性位点诱导染色质可及性的例子。AToH1激活特异性基因是否总是与内源性位点染色质可及性的增加相关?通过转录因子的强制表达进行的细胞重编程有时涉及通过使用隐性转录因子结合位点激活靶基因(Johnson等人,2018).Atoh1通过利用染色质可及性的异位位点激活HC特异性基因的频率,i.e.那些通常不会出现在超高温灭菌系统中的?报告这些发现可能很有意思。

11)KCNJ13末端外显子中依赖ATOh1的ATAC-seq峰很有趣(图6c)。especially given the role of exonic enhancers in the regulation of neighboring genes (Birnbaum et al.,2012)。作者是否探讨了KCNJ13附近的其他基因在AToH1转导反应中异位表达的可能性?作者认为,可能需要额外的转录因子来激活一些对AToH1无反应的特异性基因。尤其是在未导入基因附近获得ATAC序列峰值的情况下(图6-图补充3)。The authors should acknowledge the alternative possibility that the nearest HC specific gene may not always be the target of the putative Atoh1 dependent enhancer.

12)关于成年小鼠胞囊毛细胞分化的先前研究(Lin等人,2011;这篇手稿中引用的)表明,在立体纤毛发育的情况下,需要18天的时间才能形成清晰的分化毛细胞表型。也,近年来的一些研究表明,短暂而非组成性的ATOh1过度表达可能是毛细胞完全分化的必要条件。这些以前的研究应该得到承认。

13)是否根据“异常”选择0.1 mm与1 mm庆大霉素,用1毫米庆大霉素处理24小时后支持细胞的细长形态?除了图2-图补充1b提供的图像外,支持细胞之间的差异是如何量化的?由于1 mm导致的毛细胞损失明显大于0.1 mm,并且感觉上皮中的较大区域被剩余的支持细胞“填充”,因此这不是预期的吗?如果不量化两种情况之间的统计显著差异,当前的推理是不合理的。

https://doi.org/10.7554/188bet体育电竞elife.44328.031

Author response

基本修订:

1)作者使用两种不同的基因标记策略从胞果中分离头发和支持细胞,用于图1所示的差异表达分析。这些细胞群的纯度是不确定的。从荧光素胞浆中分离出的gfp+细胞的比例是多少?AI3小鼠被支持细胞污染,有多少GFP-CD326+细胞被毛细胞污染?This information is necessary to rigorously evaluate the sensitivity and specificity of the approach.

为了解决这个问题,我们使用两个排序协议对utricle中的头发细胞或支持细胞进行排序,然后重新分析排序后的细胞:

-用于用AToh1筛分离毛细胞;Ai3 mice,我们用APC结合CD326染色胞浆细胞,标记上皮细胞;在这里,所有的APC+VE,gfp-ve细胞被认为是受污染的支持细胞。我们观察到不到1%的污染支持细胞。

-用于从gfi1-cre分离的支持细胞;Ai3 mice and counterstained with CD326,我们重新分类了gfp-ve/cd326+ve人群并分析了gfp的表达。再一次,只有不到1%的分类细胞表达gfp,建议头发细胞污染最小。我们现在将重新排序的结果作为一个新的图1-图补充2。We can include this as a figure supplement if the reviewers wish.

从我们的分类中获得的RNA序列数据被用来生成胞毛细胞或支持细胞富集基因的列表。当我们比较纯化毛细胞和支持细胞之间的RNA序列读数时,我们发现在这两个群体中,许多基因的差异超过5000倍。这一观察结果,再加上我们对上述数据的重新排序,表明毛细胞和支持细胞特异性基因的列表可能是健全的。

2)在有和没有0.1 mm庆大霉素的情况下培养24小时的胞外植体中的毛细胞丢失数量应予以量化。

我们不能在外植体上贴标签和跟踪毛细胞,因此,在庆大霉素培养的前24小时,我们无法量化每个外植体的毛细胞数量。However,我们现在已经用caspase3底物测量了0-24小时内细胞死亡和毛细胞丢失,这些底物以前被坎宁安和他的同事用来监测胞囊中的细胞死亡。这些数据现在作为一个新的补充数字包括在内,Figure 2—figure supplement 2.我们注意到,细胞死亡在最初24小时后仍在培养基中进行,但是新的数据给人一个合理的印象,这种中等剂量的庆大霉素在治疗的前24小时的效果。

3)应报告表达myo7a的Ad-atoh1-td番茄转化的支持细胞总数。而不仅仅是记录如图2f所示的双标签单元格的百分比。

在每个外植体中,由病毒转导的支持细胞的数量各不相同,因此,我们在结果部分包含了数据,显示了作为图2中的一个新面板,我们培养的tdTom+/myo7a+细胞数的范围。以及平均值。我们认为,给予范围和平均值将给读者最好的印象,我们的感染和重新编程率如何在外植体之间变化。

4)令人惊讶的是,与Ad-Tom感染细胞(图2c)相比,Ad-Atoh1中观察到的Atoh1蛋白水平的大幅度增加并不是由Atoh1 mRNA的类似倍数增加所表示的(图2i)。什么可以解释这种差异?

图2c中的蛋白质数据是通过感染293t细胞并在2天后分析得到的。whereas the QPCR data in Figure 2I was obtained from infected utricles analyzed after 10 days,因此,这两个面板不能直接比较。我们描述得不够清楚,但我们现在已经修改了图2的文本和图例,希望能更好地解释这一点。

5)作者主要关注在USCS中激活的uhc基因,以响应损伤和AToH1转导(图3)。这也将有助于描述如下的USC基因集:而不是,受到损伤和ad-atoh1转导的抑制,因为它们也可能代表了对HC转化的重要障碍。其中一些数据报告用于图4-图补充2中的单细胞分析,但从大量RNA序列数据中进行更详细的鉴定是值得的,突出感兴趣的候选基因。

我们现在已经使用图3所示的相同方法执行了这个分析。新数据如图3-图补充2所示。We find a similar trend to that reported in Figure 3B – we find that culturing damaged utricles alone down-regulates a significant number of supporting cell genes,而ATOh1进一步下调了一个额外的,small number of supporting cell genes.支持细胞基因通常比毛细胞基因的特征要差得多,因此,根据先前发表的研究,没有一个下调的基因是值得注意的。正如审稿人所建议的,a significant number of our ~2600 supporting cell genes are NOT down-regulated by either damage and culture or Atoh1 transduction.It is indeed interesting to speculate whether expression of these recalcitrant supporting cell genes may serve as a roadblock to hair cell reprogramming,另外,头发细胞转录因子(如gfi1和pou4f3)是否有助于克服这些障碍。我们已经在讨论部分对这一点进行了扩展。

6)图3b和图c中的数据表明,一些参与立体纤毛束形成的基因在对ad-atoh1感染的反应中被上调。Authors should comment on whether HC like-cells exhibit morphological features of uHCs and provide supporting evidence.

我们没有观察到任何明显的形态特化的反分化支持细胞的光学显微镜(例如,用荧光标记的拟单抗,either with or without Atoh1.这与Forge实验室最近的研究一致,该实验室用Atoh1腺病毒转导人的胞浆。在这项研究中,作者用扫描电镜和透射电镜观察了他们的培养基。但只能观察到小的顶端小别墅的投影,together with occasional small projections reminiscent of kinocilia.It is possible that the transduced cells in both studies might develop more hair cell-like features with time (for example,林等人,2011年论文引用如下)。我们的实验室正从培养的胞外实验转向使用携带可诱导转录因子(包括AToH1)的转基因小鼠进行转录因子重编程的体内模型。但这些研究仍处于非常初步的阶段。

7)“胞外和耳蜗支持细胞再生能力的差异与毛细胞基因启动子染色质可及性相关”小节中提到的428个常见毛细胞基因在USC和CSC中是否显示接近零的表达?If not,USC和CSC在启动子和这些基因的远端元件上的染色质可及性差异可能反映了mRNA表达水平的差异。两种细胞类型的ATAC-seq和RNA-seq数据集之间应进行相关性分析。

In general,支持细胞的rpkm值比毛细胞低1-2个数量级,尽管判断是否将这些值过滤/标记为“接近零”始终是一个问题。为了帮助读者了解这些差异,我们在正文和一个新的图表中提供了12个毛细胞基因的rpkm计数的例子(图5-图补充2)。我们还对每个毛细胞基因启动子的RNA序列和ATAC序列数据进行了全局相关性分析。这表明毛细胞基因(ATAC-seq)的染色质可及性与耳蜗或胞囊支持细胞的rpkm之间的相关性非常低(r值分别为0.02和0.03)。That said,it is true that hair cell genes with higher expression levels in supporting cells display more variable chromatin accessibility signatures on average than their lowly expressed counterparts.This analysis is now provided as Figure 5—figure supplement 2.

9)USCS中的开放染色质环境是否特定于UHC基因?

很难对这个问题给出明确的答案,由于开放染色质与主动转录的基因以及可获得但未转录的基因相关。例如,支持细胞特异性基因的胞浆在支持细胞中是很明显的。支持细胞——像所有细胞一样——表达了一系列维持在转录可获取状态的家政基因。试图解决审稿人关于毛细胞基因的问题,我们筛选出那些在毛细胞和支持细胞之间表达没有显著差异的基因。对于其余显示差异表达的基因,我们确定了多少ATAC序列峰可以分配给毛细胞基因座与其他基因座。从我们的USC ATAC序列数据,我们发现了3018个可接近的峰,这些峰可以分配给超高温基因座。以及分配给USC基因座的6500个可接近峰。果不其然,我们发现了26114个可接近的峰,这些峰可以分配给其他基因,比如家政基因。因此,我们认为,与其他基因组区域相比,超高温基因座在南加州大学没有独特的开放染色质环境。我们在论文中没有包括这一分析,但如果裁判员愿意,可以加上。

10)图6中的结果突出了在受损的USCS中异位表达ATOh1会在可能或不可能与附近基因的基因激活相关的超高温特异性位点诱导染色质可及性的例子。AToH1激活特异性基因是否总是与内源性位点染色质可及性的增加相关?通过转录因子的强制表达进行的细胞重编程有时涉及通过使用隐性转录因子结合位点激活靶基因(Johnson等人,2018).Atoh1通过利用染色质可及性的异位位点激活HC特异性基因的频率,i.e.那些通常不会出现在超高温灭菌系统中的?报告这些发现可能很有意思。

为了回答这个问题,我们分离了utricle-hcs和Atoh1转导的支持细胞(ad-Atoh1)的峰。这可以解释为我们发现被AToH1表达激活的基因。下一步,我们将这些峰过滤为那些含有ATOh1靶基序的峰。总体而言,我们确定了241个在uhcs中含有atoh1位点的峰和281个在ad-atoh1支持细胞中含有atoh1位点的峰(现如图6-图补充4a所示)。有趣的是,542个(15.5%)中只有70个峰在这两个条件之间重叠。下一步,我们观察了542个峰值的ATAC-seq信号,发现Ad-Atoh1感染的支持细胞确实具有在超高细胞中未发现的高可达性位点(图6-图补充3b)。因此,分析表明,正如审稿人所建议的,ATOh1重编程经常通过在体内毛细胞中未观察到的异位部位激活HC特异性基因。We have now added this to the Results section and Discussion section.

11)KCNJ13末端外显子中依赖ATOh1的ATAC-seq峰很有趣(图6c)。especially given the role of exonic enhancers in the regulation of neighboring genes (Birnbaum et al.,2012)。作者是否探讨了KCNJ13附近的其他基因在AToH1转导反应中异位表达的可能性?作者认为,可能需要额外的转录因子来激活一些对AToH1无反应的特异性基因。尤其是在未导入基因附近获得ATAC序列峰值的情况下(图6-图补充3)。The authors should acknowledge the alternative possibility that the nearest HC specific gene may not always be the target of the putative Atoh1 dependent enhancer.

这是一个很好的观点,现在我们在讨论中强调了这一点。为了解决这个问题,我们还搜索了KCNJ13位点周围的+/-200kb。其中包括GigyF2,EFHD1和NGEF。However,这些基因中没有一个在Ad-Td番茄感染细胞和Ad-Atoh1感染细胞的表达上有差异。我们在结果部分也提到了这一点。

12)关于成年小鼠胞囊毛细胞分化的先前研究(Lin等人,2011;这篇手稿中引用的)表明,在立体纤毛发育的情况下,需要18天的时间才能形成清晰的分化毛细胞表型。也,近年来的一些研究表明,短暂而非组成性的ATOh1过度表达可能是毛细胞完全分化的必要条件。这些以前的研究应该得到承认。

我们试图在讨论部分更清楚地强调ATOh1下调与组成性过度表达的问题。鉴于左和同事报告的多西环素在内耳的持续时间,目前的tet-off技术可能不适合在成熟耳朵中提供这种暂时调节的atoh1表达。

13)是否根据“异常”选择0.1 mm与1 mm庆大霉素,用1毫米庆大霉素处理24小时后支持细胞的细长形态?除了图2-图补充1b提供的图像外,支持细胞之间的差异是如何量化的?由于1 mm导致的毛细胞损失明显大于0.1 mm,并且感觉上皮中的较大区域被剩余的支持细胞“填充”,因此这不是预期的吗?如果不量化两种情况之间的统计显著差异,当前的推理是不合理的。

我们担心,我们在1毫米庆大霉素中看到的异常形态可能反映在支持细胞基因表达的异常模式中。我们选择不通过额外的RNaseq实验来严格地进行这一研究,仅仅因为0.1毫米的治疗使毛细胞死亡,支持细胞的形态看起来与体内毛细胞损伤模型相似,such as the recent Bucks et al.paper from the Stone lab.回想起来,我们认为使用这种浓度是合理的,因为超过75%的支持胞核的细胞基因在10天的治疗后没有显著变化。如我们现在在图3-图补充2a中所示。

https://doi.org/10.7554/188bet体育电竞elife.44328.032

文章和作者信息

作者详情

  1. 辛吉仁

    Program in Developmental Biology,Baylor College of Medicine,Houston,美国
    贡献
    Conceptualization,形式分析,验证,调查,方法论,起草原稿,写作评论与编辑
    Competing interests
    未宣布竞争利益
  2. 马修克希尔

    Program in Developmental Biology,Baylor College of Medicine,Houston,美国
    贡献
    数据规约,形式分析,调查,方法论,写作评论与编辑
    Competing interests
    未宣布竞争利益
  3. 陶利涛

    1. 干细胞生物学和再生医学部,Keck School of Medicine,南加州大学洛杉矶,美国
    2. 耳鼻咽喉科-头颈外科,Keck School of Medicine,南加州大学洛杉矶,美国
    贡献
    数据规约,形式分析,调查,方法论,写作-回顾和编辑
    Competing interests
    未宣布竞争利益
  4. 盛伟伟

    Program in Integrative Molecular and Biomedical Sciences,Baylor College of Medicine,Houston,美国
    贡献
    数据规约,形式分析,调查,方法论,写作评论与编辑
    Competing interests
    未宣布竞争利益
  5. 曹文建

    分子与人类遗传学系,Baylor College of Medicine,Houston,美国
    贡献
    数据规约,形式分析,调查,Methodology
    Competing interests
    未宣布竞争利益
  6. 张宏远

    Department of Neuroscience,Baylor College of Medicine,Houston,美国
    贡献
    验证,Investigation
    Competing interests
    未宣布竞争利益
  7. 郝泽宇

    1. 干细胞生物学和再生医学部,Keck School of Medicine,南加州大学洛杉矶,美国
    2. 耳鼻咽喉科-头颈外科,Keck School of Medicine,南加州大学洛杉矶,美国
    贡献
    形式分析,Methodology
    Competing interests
    未宣布竞争利益
  8. 胡安骆驼

    1. 干细胞生物学和再生医学部,Keck School of Medicine,南加州大学洛杉矶,美国
    2. 耳鼻咽喉科-头颈外科,Keck School of Medicine,南加州大学洛杉矶,美国
    贡献
    调查,Methodology
    Competing interests
    未宣布竞争利益
  9. 程杭宗

    分子与人类遗传学系,Baylor College of Medicine,Houston,美国
    贡献
    形式分析,Funding acquisition,写作评论与编辑
    Competing interests
    未宣布竞争利益
  10. 杰姆斯·F·马丁

    1. Program in Developmental Biology,Baylor College of Medicine,Houston,美国
    2. 分子生理学和生物物理系,Baylor College of Medicine,Houston,美国
    3. 德克萨斯心脏研究所,Houston,美国
    贡献
    Funding acquisition,方法论,写作评论与编辑
    Competing interests
    未宣布竞争利益
  11. 尼尔塞吉尔

    1. 干细胞生物学和再生医学部,Keck School of Medicine,南加州大学洛杉矶,美国
    2. 耳鼻咽喉科-头颈外科,Keck School of Medicine,南加州大学洛杉矶,美国
    贡献
    Conceptualization,形式分析,Funding acquisition,写作评论与编辑
    Competing interests
    未宣布竞争利益
  12. 安得烈K树林

    1. Program in Developmental Biology,Baylor College of Medicine,Houston,美国
    2. Department of Neuroscience,Baylor College of Medicine,Houston,美国
    贡献
    Conceptualization,监督,Funding acquisition,方法论,起草原稿
    For correspondence
    akgroves@bcm.edu
    Competing interests
    未宣布竞争利益
    奥西德图标 “此orcid id标识本文的作者:”0000-0002-0784-7998

基金

国家心脏Lung血液研究所(F31hl136065)

  • 马修克希尔

国家卫生研究院(DP2EB020399)

  • 程杭宗

尤妮斯·肯尼迪·施莱弗国家儿童健康与人类发展研究所(RO1DE023177)

  • 杰姆斯·F·马丁

国家心脏Lungand Blood Institute (RO1HL127717)

  • 杰姆斯·F·马丁

国家心脏Lung血液研究所(RO1HL130804)

  • 杰姆斯·F·马丁

国家心脏Lung血液研究所(RO1HL118761)

  • 杰姆斯·F·马丁

维维安史密斯基金会

  • 杰姆斯·F·马丁

麦克唐纳研究基金(16RDM001)

  • 杰姆斯·F·马丁

基金会Leducq(跨大西洋卓越网络奖(14cvd01))

  • 杰姆斯·F·马丁

国家耳聋和其他通信障碍研究所(RO1DC015829)

  • 尼尔塞吉尔

听力健康基金会(听力恢复项目联盟基金)

  • 尼尔塞吉尔

国家癌症研究所(CA125123)

  • 安得烈K树林

国家耳聋和其他通信障碍研究所(RO1DC014832)

  • 安得烈K树林

资助者在研究设计中没有作用,数据收集和解释,或者决定将作品提交出版。

确认

我们感谢Alyssa Crowder提供的专家技术援助,感谢Groves实验室过去和现在的成员提供的帮助和建议,尤其是Dr.Rende Gu for his invaluable assistance with demonstrating utricle dissection.感谢Huda Zoghbi和Lin Gan提供老鼠,诺亚·什罗伊尔和陈敏善在贝勒为我们提供老鼠。We thank Matt Kelley and Tom Coate for their gift of Atoh1 antibodies,小韩泰协助资料分析,黄永新协助整理。我们感谢贝勒医学院的基因载体核心和Dr.Kazuhiro Oka,贝勒医学院的细胞测量和细胞分类核心,以及乔尔·M·塞德斯特罗姆的专家协助,Amanda White and Bethany Tiner. At USC we thank Welly Makmura and the Broad Stem Cell Flow Cytometry Facility for expert technical assistance.

伦理学

动物实验:本研究严格按照国家卫生研究院实验动物护理和使用指南中的建议进行。所有动物均按照批准的机构动物护理和使用委员会(IACUC)协议AN-4956(贝勒医学院)和20862(南加州大学)进行处理。

高级编辑

  1. 迪迪尔·斯泰尼尔,马克斯普朗克心肺研究所,德国

Reviewing Editor

  1. Francois Guillemot,弗朗西斯·克里克研究所,大不列颠联合王国

审稿人

  1. Donna Fekete

Publication history

  1. 收到日期:12月12日,二千零一十八
  2. 接受日期:4月28日二千零一十九
  3. 已收稿件出版:4月29日,2019(第1版)
  4. 发布的记录版本:May 7,2019(第2版)

Copyright

2019,詹等。

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