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Tgfβ信号通路对于腱细胞募集和功能性新生肌腱再生是必需的

  1. 迪帕克一个个性
  2. 克里斯汀L豪厄尔
  3. Zerina Balic
  4. 德克Hubmacher
  5. 爱丽丝H黄 是通讯作者
  1. 美国西奈山伊坎医学院整形外科学系
研究文章
引用本文作为:188bet体育电竞eLife 2020; 9: e51779 内政部:10.7554/188bet体育电竞eLife.51779

摘要

肌腱损伤通常伴有较差的愈合潜力。肌腱损伤治疗的缺乏是由于我们对驱动肌腱再生的细胞和分子途径的了解有限。利用新生肌腱再生的小鼠模型,我们发现TGFβ信号通路是驱动新生肌腱再生的主要分子途径。通过靶向基因缺失、小分子抑制和谱系追踪,我们阐明了tgf - β依赖和tgf - β独立的肌腱再生机制。重要的是,功能恢复依赖于典型的TGFβ信号转导,而功能丧失是由于这两种信号转导的新生细胞募集受损造成的Scleraxis血统和非Scleraxis-血统来源。我们发现,新生肌腱细胞招募时直接需要TGFβ信号传导,而TGFβ配体在肌腱中受到正调控。总之,这些结果显示了典型TGFβ信号在肌腱再生中的功能作用,并为区分再生和纤维化愈合的不同细胞活动提供了新的见解。

介绍

肌腱连接肌肉和骨骼,并将肌肉力量传递到骨骼。肌腱功能是通过一种特殊的细胞外基质实现的,这种基质主要由高度排列的I型胶原原纤维(Voleti等人,2012).虽然健康的肌腱通常可以抵抗高机械载荷,但由于其微小再生电位,造成损伤后,机械性能永久损害(Voleti等人,2012).这种功能丧失可导致慢性疼痛,生活质量下降,并增加再次破裂的风险。目前的治疗选择仍然有限,几乎没有细胞或生物治疗,以改善肌腱修复或诱导再生。

迄今为止,研究肌腱愈合的大多数损伤模型都会导致瘢痕介导的愈合,因为成人肌腱不会再生(Ackerman等人,2019年;染料等人。,2014年;染料等人。,2013年;Howell等人,2017年;Katzel等人,2011年;Kim等人,2011年;Mass和Tuel(1991年).尽管少数组在模型系统如胎羊和MRL/MpJ小鼠中显示了成功的肌腱再生,但在这些系统中,基因操作相对具有挑战性(Beredjiklian等人。,2003年;Paredes等人。,2018年).为了克服这些局限性,我们之前在新生小鼠中建立了一个肌腱再生模型,该模型可以直接与相同遗传背景的成年小鼠的纤维化肌腱愈合进行比较(Howell等人,2017年).通过谱系追踪,我们发现新生肌腱的再生是由腱细胞增殖、募集和分化驱动的,从而导致完全功能的恢复。相比之下,成人肌腱愈合的定义是aSMA+细胞的持续存在、腱细胞增殖或募集的缺失、软骨细胞异常分化和功能肌腱特性的丧失。识别出区分新生儿和成人肌腱愈合的细胞过程后,我们现在关注调节新生儿肌腱再生的分子途径。

尽管FGF信号最初是在鸡肌腱发育中建立的(布伦特等人,2003年),TGFβ途径随后出现为哺乳动物肌腱形成鉴定的最重要的信号通路(Havis等人,2016年;郭等人,2008;Pryce等,2009年).TGFβ超家族的成员通过II型受体信号信号信号,然后用I型受体二聚化。然后,I型受体磷酸化细胞内的Smad转录因子与Co-Smad,Smad4改变转录程序(Shi和Massagué, 2003).在小鼠胚胎中,TGFβ配体通过肌腱细胞表达,TGFβ II型受体(TβR2)或TGFβ配体的基因缺失导致肌腱完全缺失(Havis等人,2016年;郭等人,2008;Pryce等,2009年).TGFβs也诱导肌腱转录因子的表达,ScleraxisScx),在不同的实验系统中,包括胚胎肢体外植体,间充质干细胞和肌腱衍生的细胞(Brown et al., 2015;Maeda等人,2011年;Pryce等,2009年).

除了在肌腱发育和肌腱细胞分化中的重要作用外,TGFβ也是多种组织(包括成人肌腱)中纤维化瘢痕形成的已知诱导因子(Katzel等人,2011年;Kim等人,2011年;Thomopoulos et al., 2015).TGFβ作为肌纤维细胞分化的驾驶员(Border and Noble出版社,1994年出版;Desmoulière等,1993),损伤后过度释放TGFβ配体也可引起tenocyte死亡(Maeda等人,2011年).鉴于TGFβ信号在肌腱分化和瘢痕形成中的这些相互矛盾的作用,尚不清楚TGFβ信号在肌腱再生过程中是否起到积极或消极的作用。为了确定TGFβ信号在新生儿肌腱再生中的需求,我们使用了TGFβ药理抑制和基因缺失实验。我们确定了典型TGFβ信号在促进新生儿肌腱功能再生和来自两者的肌腱源细胞招募中的作用Scx和非Scx血统。

后果

新生儿损伤后TGFβ信号被激活

为了确定新生儿损伤后TGFβ信号是否被激活,我们测量了TGFβ II型受体的基因表达(Tgfbr2)和亚型Tgfb1Tgfb2,Tgfb3在伤后第3、7、14和28天进行qPCR检测。Tgfbr2在损伤后各时间点表达,并在d7和d28时与未损伤的对照组相比表达上调(p<0.01) (图1A).Tgfb1Tgfb2表达水平在交替的时间点短暂上调;然而,总表达水平相当低Tgfb2表达式(比低几倍Tgfb1Tgfb3),表明该配体在再生过程中起相对次要的作用。相比之下,Tgfb3与对照组相比,各时间点的表达均增加(图1A).与基因表达分析一致,western blot分析显示损伤肌腱在d14时Smad2/3磷酸化(pSmad2/3),提示典型TGFβ信号通路(图1B).通过ELISA对活性和总TGFB1配体的分析显示,损伤后活性TGFB1的数量没有变化,但总TGFB1显著增加(图1C).总的来说,这些结果表明TGFβ信号在新生儿肌腱再生中激活。

新生儿肌腱损伤后TGFβ信号被激活。

一个)损伤后d3、d7、d14、d28基因在正常肌腱和损伤肌腱中的表达上调Tgfbr2受体和Tgfb1Tgfb2Tgfb3配体。表达水平归一化为Gapdh采用标准曲线法(n = 5-7只小鼠)。(BD14的对照和受损肌腱的蛋白质印迹显示出损伤后的Smad2 / 3磷酸化,指示有源TGFβ信号传导(每个样品3个肌腱,n = 3个样品)。(C) ELISA检测活性和总TGFB1蛋白在第14天显示活性TGFB1没有变化,总TGFB1随着损伤而增加(每个样本3条肌腱,n = 3个样本)。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001。

功能再生需要TGFβ信号传导

检测功能性新生肌腱再生对TGFβ信号的需求(图2),我们使用成熟的小分子抑制剂SB-431542在损伤后抑制TGFβ信号14天,该抑制剂靶向TGFβ I型受体ALK 4/5/7 (Araújo-Jorge等,2012;卡拉汉等人,2002年;英曼等人,2002年;Lemos et al., 2015;Mercado-Gómez等,2014;穆罕默德等人,2017年;Pulli等人,2015年;佐藤等人,2015;Shi et al., 2017).western blotting对pSmad2/3的分析显示,SB-431542治疗对侧对照肌腱标准化后显著降低(图2 -图补充).相反,TGFβ信号转导的Smad-independent中介体phospho-p38则没有受到影响(图2 -图补充).与载体处理的小鼠相比,SB-431542处理的新生小鼠没有显示出对生长的不良影响,并且肌腱看起来基本正常(图2 -图补充).

图2附2份补充资料看到所有
TGFβ信号通路对功能恢复是必需的。

步态分析(一个) d14及(Bb -431542损伤后,d28的制动步数和推进步数均受损。(C, D经SB-431542处理后,在d28处的拉伸测试显示硬度和最大力降低。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (n = 8-10只小鼠)。

为了确定TGFβ信号在功能性愈合中的作用,我们首先分析了步态参数% brake和% propel,它们与跟腱功能高度相关(Howell等人,2017年).通过d14,载体处理的小鼠完全恢复了%制动和%推进,与功能再生一致(图2A).相比之下,SB-431542治疗组的%制动和%驱动均相对于对侧控制肢体受损。我们还观察到,相对于载体治疗的动物受伤的肢体,驱动步幅的百分比显著下降。尽管在第14天停止抑制剂治疗,但两项指标的全肢体步态缺陷均持续至第28天(图2B).

为了直接确定愈合组织的力学性能,我们在d28处对肌腱进行了拉伸试验。尽管未受伤对照肌腱的力学性能与SB-431542治疗没有显著差异,但我们观察到受伤的SB-431542治疗肌腱相对于载体的刚度和最大力降低 (图2C和D).综上所述,这些数据表明,损伤后的前14天TGFβ信号是功能性肌腱再生所必需的。

新生儿腱细胞TGFβ信号在损伤后细胞募集中是必需的

我们之前发现Scx血统(Scx新生细胞的增殖、募集和分化是新生细胞再生反应的独特特征,在成人愈合过程中未观察到(Howell等人,2017年).为了确定TGFβ抑制所观察到的功能缺陷的细胞基础,我们接下来评估了腱细胞募集是否受到TGFβ抑制的影响Scx-CreERT2鼠标(图3).有区别的Scx-表达的腱细胞在损伤前被他莫昔芬标记,在再生过程中被SB-431542抑制。非他莫西芬治疗分析Scx-CreERT2;ROSA-Ai14小鼠证实crea等位基因没有泄漏,因为TdTomato+细胞甚至在1岁时都没有观察到(图3-Figure补充1).在载体治疗的三苯氧胺注射小鼠中,后肢的整体成像显示Scx细胞(TdTomato+)在跟腱横断后第14天(图3一),而在sb -431542处理的四肢检测到很少的TdTomato信号(图3 b).从中间物质区域取的横切面定量分析证实Scx降低TGFβ信号传导抑制的腱细胞数量(图3C和D).有趣的是,当SCX腱细胞归一化为总dapi阳性细胞,这种差异被消除。细胞总数的定量分析证实SB-431542处理后细胞数量减少,提示细胞募集或增殖缺陷(1119±252载体vs 637±170 SB-431542, p=0.01)。

图3附2份补充资料看到所有
TGFβ信号在第14天的腱细胞募集中是必需的。

A、B)载体治疗组和sb -431542治疗组对照组和受伤肢体的全mount图像Scx-CreERT2;第14天ROSA-Ai14小鼠。(C)靠近中间部位的新腱横切面(黄色框)及(D)定量显示Scx减少, SB-431542处理TdTomato+细胞募集,但归一化后与总细胞无差异(n = 4-5小鼠)。(E, F)控制和受伤肢体的野生型全坐垫图像Scx-CreERT2;ROSA-Ai14和TGFBR2Scx;ROSA-Ai14老鼠。(G)靠近中间部位的新腱横切面(H)定量显示Scx减少, TGFBR2的TdTomato+细胞募集Scx突变体(n = 3只小鼠)。*p<0.05, n.s.表示p>0.05。比例尺:100µm。

由于SB-431542治疗针对所有细胞,我们观察到TGFβ信号抑制降低了新肌腱的总细胞数量,我们接下来测试了新生儿腱细胞是否直接需要TGFβ信号来招募。因此,我们删除Tgfbr2使用Scx-CreERT2TdTomato (Tgfbr2/ f;Scx-CreERT2;ROSA-Ai14;这里称为TGFBR2Scx).由于TGFβ信号是由单一的II型受体(TGFBR2)介导的,所有的TGFβ信号都随着该受体的缺失而消失。针对TGFBR2的抗体染色证实了Scx中大多数受体的缺失细胞TGFBR2Scx第14天受伤的肌腱根(图3-figure补充2).与我们的抑制剂研究一致,很少ScxTGFBR2的新肌腱中检测到腱细胞Scx突变肌腱与Scx-CreERT2伤后d14处的野生型肌腱(图3 f-h).这种差异在Scx时保持细胞归一化为总dapi阳性细胞(图3 h),因为总细胞数量的定量显示野生型和突变型肌腱之间没有差异(928±359 WT vs 976±484 TGFBR2Scx, p = 0.9)。这些数据表明,TGFβ信号是新生儿损伤后腱细胞募集所必需的,而不是TGFβ抑制其他细胞的结果。我们的数据进一步表明,虽然野生型,非scx细胞能够补偿TGFBR2的缺失Scx淘汰赛Scx当TGFβ信号在所有细胞中被系统抑制时,这种补偿就不会发生。

TGFβ信号通路对腱细胞迁移是必需的,而不是增殖

我们假设Scx的缺失在d14细胞募集与TGFβ抑制可能是由于早期细胞增殖的缺陷。在之前的研究中,我们显示了强烈的Scxd3时肌腱根切断处的肌腱细胞增生。为了检验这个假设,我们收集了Scx-CreERT2-标记的肢体损伤后d3与SB-431542治疗和TGFBR2Scx删除。与之前的发现一致,通过中间物质间隙的横切面证实Scx在损伤后,在任何条件(未示出)损伤后,细胞在D3中不可检测。EDU刺激细胞在肌腱短截线的切割位点的染色显示出相当的增殖SCX载体处理和sb -431542处理小鼠损伤后腱细胞之间的关系(图4 a - c).同样,在受伤、野生型和TGFBR2之间未检测到差异Scx突变体(图4 d-f).然而,总细胞增殖(Scx和非Scx)与sb -431542处理降低(p=0.07),而TGFBR2总细胞增殖无差异Scx突变体(图4C和F)在这个时间点,未受损伤的对照组跟腱中几乎检测不到腱细胞增殖(0-1 EdU+/Scx)+每条细胞+细胞)并且不受SB-431542治疗或TGFBR2的影响Scx删除(图4 -图补充).这些数据表明,具有抑制剂治疗的D14的降低的细胞数可能部分地归因于非SCX的增殖细胞。

TGFβ信号通路在腱细胞增殖中是不需要的。

(A,A',A')经载体治疗的受伤肌腱或(B,B',B')SB-431542-经治疗的受伤肌腱进行EdU染色,并用DAPI复染。(C) EdU和Scx的量化叠加显示Scx无差异而SB-431542处理组(n = 3只小鼠)总增殖细胞%下降。(D, D, D ')野生型肌腱受伤或(E, E, E”)TGFBR2Scx损伤肌腱进行EdU染色,并用DAPI复染(F) EdU和Scx的量化覆盖显示在Scx中没有差异TGFBR2损伤后细胞增殖或总细胞增殖Scx缺失(n = 3只小鼠)。A ', B ', D ', E '是从A ', B ', C ', D '中显示的黄色框区放大的图像。白色箭头表示EdU+, Scx单元格n.s.表示p>0.1。比例尺:100µm。

自从Scx的增殖细胞在d3时没有受到影响,我们接下来确定TGFβ信号是否可能是腱细胞迁移所必需的。体外划痕试验用于诱导细胞迁移(图5一个).单独在DMEM中,腱细胞在任何时间点都不迁移。直到12小时,DMEM和DMEM+FBS才观察到伤口愈合的差异。相比之下,添加TGFB1可显著增强细胞迁移,创面愈合早在划痕后4小时就可发现差异,8小时后创面几乎完全愈合(图5一个).确认Scx发生了加速迁移细胞,我们标记肌腱Scx-CreERT2P2和P3处的小鼠,以及P7处从未受伤的肌腱中分离的细胞。我们观察到Scx增强TGFB1处理后的细胞迁移(图5 b).量化的ScxEdU检测到的增殖细胞增殖极小,不同处理组之间没有检测到差异(图5 b).非scx的EdU量化DMEM+FBS+TGFB1组(2.89±1.24%)与3.46±2.01%(3.26±1.23%)比较,p=0.8。

TGFβ促进体外新生儿10细胞迁移。

一个)相位反差图像及(B体外创伤定量分析显示,相对于DMEM和DMEM+FBS条件,TGFB1的补充加速了创伤的愈合(n = 6)。C)相位反差及(D)荧光图像显示增强(E) ScxTGFB1处理后的细胞迁移。(F)在8小时(n = 5-6)的细胞增殖中没有观察到差异。* P <0.05,*** P <0.001,**** P <0.0001。N.S.p> 0.1。

总的来说,这些结果表明TGFβ信令需要在损伤后募集新生儿胞胎细胞,并且该腱鞘募集需要活性细胞迁移,而不是通过细胞增殖扩增。相反,非SCX的增殖d3时的细胞可能依赖于TGFβ信号。

损伤肌腱中TGFβ配体产生的增加依赖于TGFβ信号传导

尽管Scxd3时间隙内没有细胞,该区域并非没有细胞。在这个时候,我们观察到早期积累的αSMA+细胞不是来自ScxHowell等人,2017年).令人惊讶的是,αSMA的免疫染色显示,d3时αSMA+细胞募集不受TGFβ抑制或Tgfbr2删除(图6a,b).通过中间物质间隙的横切面也证实了Scx在任何条件(未示出)中,细胞在D3中尚未检测到。在SCX之前间隙空间内的αsma+细胞的存在细胞募集表明这些细胞可能是TGFβ配体的来源,向腱细胞发出迁移信号。对所有三种TGFβ亚型的免疫染色显示,受伤肌腱的间隙间隙和对照肌腱的中间物质之间的信号水平相当(图7 a, B).因此,我们认为配体的产生可能是由TGFβ信号调节的,而募集受损是由于TGFβ配体的减少和SB-431542的抑制。然而,TGFβ配体的免疫染色显示,在载体-和sb -431542处理的肢体损伤间隙内,染色强度相同(图7 a, B).仅在切口处受伤的肌腱中观察到差异。我们发现,与未受伤对照组相比,载体治疗的受伤肌腱切割部位的配体染色增加,但SB-431542抑制作用并未出现这种增加(图7C、D).由于该抗体不能区分潜在的和活性的TGFβ配体,我们也通过ELISA定量了活性的TGFB1蛋白,但d14在全腱裂解液中没有检测到差异,无论损伤或治疗(图7 e).这些数据表明,TGFβ信号在d3损伤时上调TGFβ配体是必需的,并且这可能在新生儿腱细胞中自主调节。

αSMA+细胞的募集不受TGFβ抑制或TGFBR2的影响Scx删除。

在d3处通过间隙空间的横切面显示出丰富的αSMA+细胞,具有(一个)SB-431542治疗或(B)TGFBR2Scx缺失程度与携带者治疗或野生型相当。黄色虚线轮廓突出显示以前由跟腱占据的间隙区域。

损伤后TGFβ配体的合成受TGFβ信号通路调控。

一个横切面通过中间体肌腱和新肌腱区域,d3用抗所有三种TGFβ亚型的抗体免疫染色。(B强度水平定量显示各组间染色无差异。(C)通过肌腱切割位点区域的横截面,在D3免疫染色,用抗体免受所有三种TGFβ同种型的抗体。(D强度水平的量化显示,载体治疗肌腱损伤后TGFβ配体增加,而SB-431542治疗不再观察到这种情况。黄色虚线表示感兴趣的区域量化。(E) ELISA法测定TGFB1蛋白含量,结果显示,在第14天,损伤组和SB-431542处理组的TGFB1蛋白含量无显著差异。*p<0.05 **p<0.01 n.s.表示p>0.1。天平条:100µm。

Non-Scx胎生物细胞也有助于Neotencon形成

虽然d3时存在αSMA+细胞,但d14时免疫染色普遍显示αSMA+细胞减少。然而,相对于载体,SB-431542处理的αSMA+染色更多(图6 -图补充).这可能表明,αSMA+细胞在TGFβ抑制或维持前体或肌成纤维细胞表型的情况下持续时间更长。因为之前的研究使用Acta2-Creert2.行动2是αSMA的基因,表明αSMA成年谱系(αSMA)肌腱周围的副腱细胞是肌腱的常驻祖细胞(染料等人。,2013年),我们假设αSMA+细胞招募到间隙空间(不是Scxd3)可能向肌腱谱系分化,从而关闭αSMA。分析Scx-GFP在载体治疗的受伤肢体中表达确实显示了非scx群体Scx-GFP+细胞在新腱内(图8 a, B).与对侧非损伤对照组比较,Scx不完全重组细胞不能解释这一现象,因为在对照肌腱中重组效率为~96.4%。非scx的量化Scx-GFP+ (Scx-GFP只有)人口显示出更少Scx-GFP- 在SB-431542治疗的小鼠损伤后,在新生儿中的细胞(图8汉英).DAPI+细胞呈比例下降,说明DAPI+细胞减少Scx-GFP只有细胞可能不会由于细胞间隙内的失败而分化。分析TGFBR2Scx突变体在d28也显示存在Scx-GFP-仅当Scx细胞被最少招募(图8 -图补充).

人口的Scx-GFP+,非Scx新生儿肌腱损伤后招募细胞。

对照和受伤肢体新肌腱横切面(A、B)载体处理及(C, D)SB-431542-1Scx-CreERT2;ROSA-Ai14;Scx-GFP老鼠。(E, F)非Scx的量化Scx-GFP+细胞显示使用Sb-431542处理的细胞数的降低,但在归一化至总DAPI +细胞(n = 3只小鼠)时。* P <0.05。N.S.p> 0.1。速度栏:100μm。

确定这些非SCXScx-GFP+细胞来源于αSMA+细胞,用它莫昔芬在P2、P3标记细胞Acta2-Creert2.老鼠。对P5处的横向冷冻切片的分析显示了出乎意料的重组量Scx-GFP腱细胞(图8 -图补充).对照组和未损伤肌腱的αSMA免疫染色证实,新生儿腱细胞正常情况下不表达αSMA。测定αSMA的招募和分化细胞,我们在P2、P3标记细胞,在P5处损伤肌腱,在d14处采集肢体。尽管在d14处出现最小的αSMA免疫染色(图6 -图补充),检测αSMA细胞(TdTomato+)在新腱和大部分αSMA细胞出现Scx-GFP-否定的(图8-图补编3).除了TdTomato+/Scx-GFP-细胞,我们也鉴定了TdTomato+/Scx-GFP+细胞和Scx-GFP+细胞在载体和SB-431542处理的新腱(图8-图补编3).

d14处αSMA的免疫染色结果表明,具有系统性TGFβ抑制的祖细胞表型持续存在(图6 -图补充).为了测试肌腱细胞分化是否受到影响,我们在损伤后D3和D14的实时QPCR确定肌腱标记基因表达。在D3,肌腱标记Scx类似Mkx,Tnmd与对侧未受伤对照组相比,载体治疗的受伤肌腱的损伤率降低(图9).有趣的是,与载体对照相比,SB-431542抑制TGFβ信号转导也降低了未损伤对照肌腱中肌腱标记基因的表达。通过d14,无论治疗或损伤,肌腱标记基因表达均未发生改变(图9 b).表达水平的SOX9.行动2在两个时间点上的实验条件没有差异(图9 a, B).总的来说,这些数据表明,尽管在腱源细胞募集、肌腱标记基因表达和损伤后伸展肌腱细胞分化方面存在缺陷,但TGFβ信号通路的抑制在很大程度上没有影响。

损伤d14后,肌腱标记基因表达不受TGFβ信号抑制的影响。

在(一个) d3及(B) d14来自载体处理和sb -431542处理的动物(n = 4-6只小鼠)。在载体处理的小鼠损伤后,肌腱基因降低,但在d3时SB-431542处理没有降低。d14不再检测到差异。SOX9.行动2在两个时间点上均无显著差异。* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * * p < 0.0001。

讨论

在这项研究中,我们确定了tgf - β依赖和tgf - β独立的过程有助于新生儿肌腱再生。我们发现Scx的早期增殖腱细胞和aSMA+细胞的激活不依赖于TGFβ信号通路。然而,非scx的扩散细胞,随后招募的腱生细胞(来自Scx和非Scx来源),功能恢复依赖于TGFβ信号通路(图10).TGFβ信号是许多细胞过程的已知调节器,包括细胞增殖,迁移和分化(Shi和Massagué, 2003)在肌腱中,TGFβ信号对胚胎肌腱发育以及肌腱细胞命运的诱导和维持至关重要(Pryce等,2009年).然而,损伤后,TGFβ信号也被认为是纤维化、疤痕介导愈合的驱动因素,过度TGFβ信号导致腱细胞凋亡(Davies等人,2016年;Katzel等人,2011年).因此,在肌腱再生的背景下,尚不清楚TGFβ是否在肌腱分化中必需,或TGFβ的激活是否会驱动纤维化反应。利用我们之前建立的新生儿肌腱再生模型,我们在这里表明,TGFβ信号在损伤后被诱导,并且是新生儿腱细胞募集到损伤部位所必需的。由于损伤后的腱细胞增殖不受TGFβ信号抑制的影响,我们提出,腱细胞介导的再生需要细胞主动迁移来弥补间隙。这进一步得到了体外数据的支持,显示TGFβ配体存在时新生儿tencytes的迁移增强,这与其他细胞类型的几项研究一致(Shi和Massagué, 2003).

新生儿肌腱再生中TGFβ信号通路的需求。

新生肌腱再生过程中tgf - β依赖和tgf - β不依赖的细胞过程概念模型的示意图描述。虽然d3时腱细胞增殖和αSMA细胞募集独立于TGFβ信号通路,但随后的腱细胞募集和功能性肌腱组织恢复需要TGFβ信号通路。

除了腱细胞外,我们还发现了第二个非scx群体Scx-GFP+招募到间隙空间的细胞。TGFβ信号的抑制也导致这些细胞数量的减少。这些细胞的一个潜在来源可能是腱鞘,因为之前有人提出腱干/祖细胞驻留在腱鞘(染料等人。,2014年;染料等人。,2013年;Gumucio et al., 2014;Mendias等人。,2012年;Mienaltowski等人,2013).虽然使用Acta2-Creert2.在成人的上皮细胞/副上皮细胞中显示限制性标记(染料等人。,2014年),我们发现在新生儿期腱细胞中有相当多的标记。受伤后,αSMA细胞被招募到新肌腱,提示这可能是非scx的来源Scx-GFP细胞。然而,并不是所有的Scx-GFP该系细胞来源于αSMA因此,不能排除肌腱生成细胞的其他来源的可能性Acta2-Creert2.这只是未受伤的腱龙的一个亚种群Scx-GFP这些小鼠中只有Scx细胞,非αSMA人口。双标记αSMA和Scx需要细胞来验证这一假设;然而,目前使用现有的遗传工具无法做到这一点。肌腱生成细胞的其他来源包括肌腱相关的血管系统,因为已经在肌腱附近发现了CD146+周细胞(Lee等,2015年).自Scx-GFP也可以更广泛地表达与trueScx表达式(Best and Loiselle, 2019;普莱斯等人,2007年), non-Scx/Scx-GFP和非-αSMA/Scx-GFP检测到的种群也可能是转基因报告的一个局限性,而不代表新的tenogenic细胞种群。这些问题可以通过使用已排序Scx的单单元RNASeq来解决和αSMA在未来的研究中。

不像Scx细胞,αSMA经SB-431542处理后,d14处的新腱中存在细胞,这与免疫染色结果一致,显示d3处存在大量αSMA+细胞。但是,需要进行定量测量,以确定这些细胞的增殖或募集是否受SB-431542处理的影响。除αSMA外/Scx-GFP+在d14处占据新腱的细胞,我们也鉴定出αSMA/Scx-GFP——细胞。在这个时间点上,这些细胞的αSMA免疫染色基本为阴性,但未采用tenogenic表型。这一群体在肌腱再生中的作用尚不清楚,但他们可能支持腱生细胞,自身经历腱发生,或也采用纤维表型。此外,还不清楚是否αSMAD3的间隙空间中的细胞是在D14的NeoTendon中观察到的相同的细胞,或者它们是否代表在愈合反应的后期阶段的第二波细胞募集。可以在未来的研究中进行具有定量测量,时间标记和局部化消融的额外实验,以完全阐明αsma的动态以及它们与Scx的相互作用及其在肌腱再生和纤维化中的作用。尽管TGFβ信号抑制后腱生细胞募集受损,但腱生标记物的表达ScxTnmd,类似Mkx在d14处没有差异。识别肌腱细胞命运的其他标记物是正在进行的研究的重点。

我们在细胞间隙中发现了TGFβ配体的一个潜在来源,它可能驱动腱细胞从根部的定向迁移。损伤后,肌腱根中TGFβ配体增加,这被TGFβ信号通路的小分子抑制所抑制。这表明TGFβ信号的启动导致腱细胞的正反馈。我们还观察到非scx的增殖和招募的需求细胞,但仅使用SB-431542处理,而不使用TGFBR2Scx突变体(只针对Scx中的TGFβ信号细胞)。这表明在没有Scx的情况下细胞募集,有代偿性增殖或非scx募集这些细胞也依赖于TGFβ信号。tgf β的其他来源可能是免疫细胞,已知它们能分泌tgf β。在三种TGFβ亚型中,基因表达数据表明,驱动新生儿再生的主要配体可能是TGFβs 1和3。虽然Tgfb1呈双峰上调模式,Tgfb3在受伤后一直上调。令人惊讶的是,在第14天对TGFB1蛋白的分析显示,只有总TGFB1发生了很大的变化,而活性TGFB1没有变化。TGFβs通常以潜伏形式与细胞外基质中的LTBPs结合分泌,可由蛋白酶或机械(如横断损伤)诱导TGFβs释放到活性形式(Maeda等人,2011年)通常认为配体信号只能在LTBP释放TGFβs时发生。然而,最近使用cryo EM的研究表明,TGFβ激活也可以在LTBP不释放的情况下发生。这一机制取决于与整合素αvβ8的相互作用(坎贝尔等人,2020年).另外,也有可能信号主要是由活性的TGFB3介导的,但尚未测量到(目前还没有有效的ELISA试剂盒来专门检测组织裂解物中的小鼠TGFB3)。在胚胎发育期间,Tgfb2Tgfb3在肌腱中表达,这些配体的等位基因缺失导致肌腱损失增加(郭等人,2008;Pryce等,2009年);在伤害的情况下,Tgfb3的表达,而TGFB1与纤维化的成年肌腱愈合相关(Beredjiklian等人。,2003年;Kim等人,2011年).尽管这支持TGFβs 2和3相对于TGFB1是促腱生成的观点,但目前尚不清楚这两种配体是否真的能激活不同的愈合或腱生成反应。因此,必须进行更多的研究,以阐明它们的活动。

尽管在这项研究中尚未确定成年肌腱的愈合情况,但已经确定的是,成年损伤后TGFβ信号升高,导致纤维化瘢痕形成(Leask和Abraham, 2004年).通过中和抗体或通过Smad3-/-缺失可减弱纤维化,但不能再生肌腱结构或功能(Katzel等人,2011年;Kim等人,2011年).我们之前的研究表明,成年腱细胞在完全横断损伤后基本上是静止的,只有最小的细胞增殖或募集。新生儿和成年腱细胞对TGFβ的独特反应可能反映了内在电位的差异(例如成年腱细胞是有丝分裂后的)或其他信号通路的激活,这些信号通路可能与TGFβ信号相互作用或修改。除了Smad信号外,TGFβs还可以激活一些非Smad信号通路(张,2017);新生儿和成人腱细胞的下游信号可能存在差异。使用体外工程肌腱模型,我们之前证明TGFβ信号通路的肌腱生成结果并不依赖于此Smad4简等人,2018).这一发现是否适用于体内损伤仍有待确定。

材料和方法

关键资源表
试剂类型
(物种)或
资源
指定 源或
参考
标识符 额外的
信息
遗传试剂(m .骶 stzr Tg (Scx-GFP) 1
(ScxGFP)
Ronen施韦策
普莱斯等人,2007年
RRID:MGI: 3717419
遗传试剂(m .骶 Scx-CreERT2 Ronen施韦策 不适用
遗传试剂(m .骶 ikal Tg (Acta2-cre / ERT2) 1(Acta2-CreERT2) Ivo Kalajzic
Grcevic等,2012
RRID:MGI: 5461154
遗传试剂(m .骶 Gt (ROSA) 26琼tm14(CAG)Hze
(ROSA-Ai14)
杰克森实验室
Madisen等人,2010年
库存:007908
RRID:MGI: 3809524
遗传试剂(m .骶 Tgfbr2tm1.1Hlm
(Tgfbr2)/ f
哈罗德·摩西
Chytil等人,2002
RRID:MGI: 2384512
化合物、药物 sb - 431542 Stemgent 猫。# 04-0010-10
抗体 抗αSMA(小鼠单克隆抗体) 西格玛·奥尔德里奇 类别#A5228
RRID:AB_262054
(1:10 0)
抗体 抗tgfb1,2,3 MAb(克隆1D11,小鼠单克隆) 研发系统 猫#MAB1835
RRID:AB_357931
(1:50)
抗体 人抗TGFBR2(山羊多克隆) 研发系统 猫。# af - 241 5 ug /毫升
抗体 驴抗兔Cy5(兔多克隆)
杰克逊ImmunoResearch 第711-175-152类RRID:AB_2340607 (1:400)
抗体 Strepdavidin Cy5 杰克逊ImmunoResearch 猫。# 016-170-084 RRID:AB_2337245. (1:400)
抗体 抗磷酸化- Smad2/3(兔多克隆) 细胞信号传导 猫。# 8828
RRID:AB_2631089
(1:1000)
抗体 Anti-phospho-p38(兔单克隆) 细胞信号传导 猫。# 4511
RRID:AB_2139682
(1:1000)
抗体 Anti-GAPDH(鼠标单克隆) 微孔σ 猫。# MAB374 (1:1000)
抗体 山羊抗兔红眼病(兔多克隆) 利科尔 猫。# 926 - 68071
RRID:AB_2721181
(1:10,000)
抗体 山羊anti-mouse IRDye
(鼠标多克隆)
利科尔 猫。# 926 - 32210
RRID:AB_621842
(1:10,000)
软件、算法 ZEN数字成像光学显微镜 蔡司https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.金博宝体育电竞html RRID:SCR_013672
软件、算法 ImageJ imagej(http://imagej.nih.gov/ij/ RRID:SCR_003070
软件、算法 Graphpad棱镜 GraphPad Prism(https://graphpad.com RRID:SCR_015807

实验程序

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使用下列鼠标线:Scx-GFP肌腱记者(普莱斯等人,2007年),Scx-CreERT2(由R. Schweitzer生成),Acta2-Creert2.Grcevic等,2012), ROSA-Ai14 Cre记者(Madisen等人,2010年),Tgfbr2/ fChytil等人,2002).通过将玉米油中的三苯氧胺注入P2和P3新生小鼠(1.25 mg/幼鼠)进行谱系追踪和Cre缺失(Howell等人,2017年).在采集前2小时给予0.05 mg EdU标记增殖细胞。使用成熟的小分子抑制剂SB-431542 (10 mg/kg in 5% DMSO,腹腔注射)进行了TGFβ整体抑制,该抑制剂靶向TGFβ家族I型受体ALK 4/5/7 (汉密尔顿等人,2014年;英曼等人,2002年;拉平等,2002;Lemos et al., 2015;Waghabi等人,2009年)。从受伤后第0-14天开始每日注射SB-431542或载体。在第5天对新生儿进行无修复的跟腱全横断,雄性和雌性小鼠均匀分布在各组之间。所有程序均由西奈山机构动物护理和使用委员会批准。

迁移分析

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用1% 1型胶原酶(Cat)消化从P7幼崽中分离出新生腱细胞。# LS004188,沃辛顿,莱克伍德,新泽西州)和胶原酶4型(猫。# LS004188, Lakewood, Worthington, NJ) 4小时。在高糖DMEM (Cat。# 11965092, Life Technologies,卡尔斯巴德,)含10%胎牛血清(FBS、Life Technologies、,卡尔斯巴德,)和1%的PenStrep (Life Technologies,卡尔斯巴德,).对于迁移试验,细胞在血清中饥饿24小时,然后仅在DMEM、DMEM+10%FBS或DMEM+10%FBS+10 ng/mL TGFB1(明尼苏达州明尼阿波利斯市240-B类研发系统)中保存。使用P200尖端沿每口井的中线刮下。然后每4小时拍摄一次相衬度和荧光图像,共12小时。通过在收获前将细胞与0.05 mg EdU/孔孵育30分钟来测量细胞增殖。根据制造商的说明(Cat.#C10340,Life Technologies,卡尔斯巴德,).

全荧光成像

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后肢用4%多聚甲醛(PFA, Cat。# 50-980-495, Fisher Scientific, Waltham, MA)在4°C下过夜,切除皮肤,暴露跟腱。使用具有荧光功能的Leica M165FC立体显微镜捕捉后肢的全安装图像。暴露设置保持横跨四肢。

免疫荧光和显微镜

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牺牲后,四肢在4°C的4%PFA中固定24小时,在4°C的50 mM EDTA中脱钙1-2周,然后在4°C的5%蔗糖(1小时)和30%蔗糖(隔夜)中孵育。然后将四肢嵌入最佳切割温度培养基(Cat.#23-730,费希尔科学,沃尔瑟姆,马萨诸塞州)使用针对αSMA(Cat.#A5228,Sigma,St.Louis,MI)、TGFB1,2,3配体(Cat.#MAB1835,R和D系统,明尼苏达州明尼阿波利斯市)、TGFBR2(Cat.#AF-241,R和D系统,明尼苏达州明尼阿波利斯市)的一级抗体进行免疫染色,并使用与Cy5结合的抗体进行二级检测(目录号:711-175-152;016-170-084,宾夕法尼亚州西格罗夫市杰克逊免疫研究所)。根据制造商的说明(目录号:C10340,生命技术,卡尔斯巴德,).荧光图像使用Zeiss Axio成像仪通过apoome光学切片或使用徕卡DMB6显微镜获得。用Zeiss Zen或Image J软件对冷冻切片横向图像进行细胞定量。在ImageJ中通过测量灰度图像的平均强度获得免疫荧光测量值。所有用于定量的图像都是在相同的曝光和图像处理应用于相同的样本。

RNA分离、逆转录和qRT PCR

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三苯酚/氯仿萃取用于将RNA与解剖筋分离出来。然后通过使用上标Vilo主混合物(猫。#11755050,Invitrogen,Carlsbad,CA)通过逆转录来合成cDNA。使用SYBR PCR主混合物(猫。#4309155,Thermo Fisher,Themo Fisher,沃尔瑟姆,马),用标准曲线法或2–∆∆计算机断层扫描与载体处理的对照肌腱相关的方法。管家基因,Gapdh,用来规范基因表达。tgf β相关分子的引物序列见补充文件1.所有其他引物之前已描述(Howell等人,2017年).

蛋白质提取

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肌腱在液氮中冷冻,然后在Geno/Grinder中以1500转/分钟的速度粉碎90秒。将粉碎后的肌腱重悬于150 μL T-PER组织蛋白提取试剂(Thermo Scientific, 78510)中,并添加cOmplete蛋白酶抑制剂(Roche, 04693159001)和PhosSTOP磷酸酶抑制剂(Roche, 4906845001)。为使肌腱溶解,在4°C下端-端旋转1小时,然后在10 A超声30 s。最后,样品在10000 x g下清洗5分钟,收集上清液进行western blot分析和ELISA。使用Bradford assay (Thermo Scientific, PI23238)和NanoDrop分光光度计(Thermo Scientific)测定蛋白浓度。

西方墨点法

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蛋白提取液与5x还原十二烷基硫酸钠和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)缓冲液在95℃下孵育5分钟。将等体积的样品加载到7.5%的聚丙烯酰胺凝胶上,使用Mini-PROTEAN Tetra垂直电泳系统(Bio-Rad)在80 V下分离20分钟,然后在120 V下分离1小时。分离的蛋白质后,凝胶被转移到poly-vinylidene二氟化物(PVDF)膜(Immobilon-FL IPFL00010)使用迷你Trans-Blot细胞(Bio-Rad)在70 V 90分钟。蛋白质转移后,膜被封锁在RT为1小时5%牛血清白蛋白(BSA)在Tris-buffered盐水(TBS)。然后用兔多克隆抗体phospho-Smad2/3 (Cell Signaling Technology, 8828)、单克隆抗体phospho-p38 (Cell Signaling Technology, 4511)和小鼠GAPDH单克隆抗体(Millipore Sigma, MAB374)作为负载对照,孵育印迹。用0.1% TWEEN-20 (TBS)稀释5% BSA, 1:1000, 4°C过夜。然后用TBS-T洗涤印迹3次,共5分钟,并与IRDye 680RD山羊抗兔和IRDye 800CW山羊抗小鼠二抗(Licor,926-68071和926-32210)以1:10 000稀释5% BSA在TBS- t中2小时。TBS- t洗3次5分钟,TBS洗一次5分钟,用Licor Odyssey成像系统成像。用ImageJ软件量化单个条带的荧光强度,并归一化至GAPDH。

ELISA法检测TGFB1

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按照厂家说明书使用TGFB1 Quantikine ELISA Kit (R and D Systems, DB100B)对未稀释的蛋白提取物进行检测。为了评估TGFB1的总量,用1N HCl孵育样品10分钟,用1.2N NaOH在0.5M HEPES中中和,从而激活潜在的TGFB1。使用SpectraMax酶标仪和SoftMax Pro软件对标准曲线(0-1000 pg/mL TGFβ1)进行定量。

步态分析

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使用DigiGait成像系统(Mouse Specifics Inc,Quincy,MA)以10 cm/s的速度让小鼠行走3-4秒。使用高速数码相机捕捉前肢爪的位置,然后提取先前为小鼠跟腱损伤确定的参数(Howell+,Sci Rep,2017).所有参数均标准化为步幅,以说明动物大小和年龄的差异。

生物力学测试

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使用定制3D印刷夹具在PBS中在PBS中进行拉伸测试,以确保骨库和Achilles肌腱(亚伯拉罕等人,2019).钢筋束预加载至0.05N,持续约1分钟,然后以1%/s的速度逐渐失效。记录结构特性;由于组织尺寸较小,无法准确测量横截面积,因此未分析材料特性。

统计分析

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定量结果以均数±标准偏差表示。采用两种方差分析比较两个自变量(损伤和TGFβ抑制);当检测到显著性时,进行后验(Graphpad Prism)。所有其他定量分析使用学生t检验进行分析。显著异常值可用Grubb’s test (Graphpad Prism)检测。步态和机械性能量化的样本量由功率分析计算,功率为0.8%,I型误差为5%。其他定量数据的样本大小是基于实验室以前的数据和已发表的文献。差异有统计学意义(p<0.05)。

参考

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  3. 3.
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    TGF-Beta信令和纤维化反应
    1. 一个Leask
    2. DJ亚伯拉罕
    (2004)
    美国实验生物学学会联合会杂志 18: 816 - 827。
    https://doi.org/10.1096/fj.03-1273rev
  28. 28
  29. 29
  30. 30.
  31. 31
  32. 32
  33. 33
  34. 34
  35. 35
  36. 36
  37. 37
  38. 38
  39. 39
  40. 40
  41. 41
  42. 42
  43. 43
  44. 44
  45. 45
  46. 46
  47. 47

决定书

  1. 局部激素扎伊迪
    审核编辑;Icahn医学院在西奈山,美国
  2. Clifford J罗森
    美国缅因州医学中心研究所高级编辑
  3. 美湾
    评论家;美国约翰霍普金斯大学医学院
  4. 阿莱娜·洛伊塞尔
    评论家;美国罗彻斯特大学医学中心
  5. Nathanial Dyment
    评论家;宾夕法尼亚大学,美国

为了提高透明度,eLife会发布最实质性的修订请求以及相应的作者回复188bet体育电竞。

验收总结:

我们感谢你周到的答复。这篇论文是对现有的肌腱生物学文献的新补充。它描绘了新生肌腱再生的分子基础,并特别强调了TGFβ信号的作用。通过靶向基因缺失、小分子抑制和谱系追踪,该出版物确定了tgf β依赖和非依赖的细胞机制参与肌腱再生。

同行评审决定信:

感谢您提交文章“TGFβ信令是Tenocyte招募和功能性新生儿肌腱再生所必需的”考虑188bet体育电竞.您的文章已由三位同行审稿人审阅,评审编辑莫恩·扎伊迪和高级编辑克利福德·罗森负责监督评审工作。以下参与审阅您提交的意见书的人员同意透露他们的身份:Mei Wan(审稿人#1);Alayna E Loiselle(第二名审稿人);Nathanial Dyment(审稿人#3)。

审稿人相互讨论了这些评论,审稿人起草了这个决定,以帮助您准备修改后的提交。

概括:

这些研究潜在地揭示了一种新的调节新生肌腱再生的分子途径。然而,对该方法和方法有几个重要的关注点。审评者认为有必要验证SCXCRERT2/ROSAT小鼠的标记特异性,证明小化合物/TβR2K的抑制效率。O对TGFβ信号传导的影响;并评估细胞增殖。

必要的修正:

1)关于Tgfb途径的药理学和遗传抑制的证据很少,尤其是在使用化学抑制剂的剂量下。报告ScxCreERT2/RosaT小鼠的标记特异性需要进一步验证,特别是在没有他莫昔芬的情况下可能存在的渗漏。排除假阳性积极性是必不可少的。此外,目前还不清楚非scx, ScxGFP+细胞在愈合过程中也被aSMACreERT2小鼠标记。

2)另一个问题与功能性活性Tgfb的测量有关,并将其表示为总Tgfb的比例。这是因为TGFβ通过潜伏期相关蛋白(LAP)表达,通过掩盖许多不同组织(包括肌腱)的细胞外基质(ECM)使其失去活性。TGFβ没有功能,除非它被激活。因此,肌腱组织中TGFβ的mRNA水平(图1)并不反映TGFβ信号通路的激活。应测量活性TGFβ/总TGFβ比值。

3) Smad2/3磷酸化的western蛋白需要复制和定量,以确定靶点的参与和抑制。

4)为了提高清晰度和巩固结论,需要有关扩散和迁移的新数据。建议采用体外细胞增殖试验。同样重要的是,作者定量的增殖细胞,并提出这些总%的增殖细胞。同时进行划痕分析来评估迁移将是一个有价值的补充。最后,作者应该检查TBR2缺乏的胎癣菌中的迁移,以进一步支持腱鞘内效应。

其他需要解决的问题:

1)考虑到ScxGFP构建物比内源性Scx表达模式更广泛,Tmx标记应在~D7-10损伤后确认ScxGFP和ScxAi4细胞重叠。

2) ScxGFP细胞募集减少是否也发生在TβR2中,这是一个问题Scx老鼠?这可能需要更详细的研究。

3)图3和图4中rosat标记细胞之间的明显差异需要解决。图3B和C中“在sb -431542处理的肢体中检测到很少的RosaT信号”和“很少的Scx”TβR2中检测到腱细胞Scx然而,有许多红色的Scx示sb -431542处理的腱细胞(图4B'和B')和TβR2Scx突变体肌腱。这种差异的原因是什么?

4)图7中,TGFβ配体在SB-431542处理的损伤小鼠中减少。作者的结论是,TGFβ信号通路对于损伤时TGFβ配体的上调是必需的。这个结论令人困惑。

5)作者先前发现成人愈合中腱细胞募集不足,但新生儿中腱细胞募集适当——这是大小/距离的函数,因为其他多个模型显示了桥接组织,还是这是AT的特殊发现?

6)图3D:作者将抑制剂处理过的动物中TdTomato+细胞招募#的巨大变化归因于什么?这些数据还应作为桥接组织中总细胞的百分比进行分析。这将证明抑制是否影响所有细胞募集,或具体到Scx

7)图4:除了对载体和WT进行Edu标记的归一化,增殖细胞的总%还可以了解Tgfb抑制或缺失对一般细胞动力学的影响。

8)补充图3/图7:TGFb配体染色强度如何量化?因为我认为作者的主要观点是存在空间差异,所以将这些数据放在同一个图表上,并从间隙空间获得具有代表性的图像是合适的。另外,图7A中的两种不同色斑(紫色/绿色)是什么?理想情况下,通过ELISA定量分析配体水平将是最有说服力的,但我认识到这在技术上的挑战。

9)已知TGFb可刺激培养细胞增殖。似乎细胞在划痕试验之前并没有血清饥饿,或者在其中一组中没有添加增殖抑制剂(如丝裂霉素C)。因此,很难确定这些变化是由于迁移还是增殖造成的。用Tgfbr2 cKO细胞做划痕实验,这也将是一个更好的平行于体内研究的方法。

10)本文不建议将aSMA+细胞仅称为肌成纤维细胞。其中一些可能是肌成纤维细胞,但不是全部。尽管aSMA是肌成纤维细胞的标记物,但所有表达aSMA的间充质细胞都不是肌成纤维细胞。aSMA在促进组织愈合的祖细胞群扩展过程中表达。这些细胞继续分化为ScxGFP+细胞、骨细胞、纤维软骨和成牙细胞。另一方面,肌成纤维细胞是一种更成熟的细胞类型。肌成纤维细胞的关键定义特征是体内应力纤维和收缩力的重新发展。含有aSMA的应力纤维产生更高的收缩力,这就是为什么肌成纤维细胞表达aSMA。尽管TGFb是肌成纤维细胞的有效诱导剂(如讨论的第三段所述),但SB-431542在早期阶段并没有抑制aSMA的表达,这也表明这些细胞可能不是肌成纤维细胞。

11)建议作者在主图中添加未受伤的肢体,而不是图2 -图的补充1。面板A和面板B的四肢没有受伤,这样可以很好地平衡画面。

12) 图4C–这将有助于在图表上指出Scx的扩散细胞是报道。

13)图6 -图补充1 - sb -431542处理组在D14时aSMA染色是否更高?这可能进一步支持治疗组的愈合减弱/延迟。

14)图7和图8的标题相同。

https://doi.org/10.7554/188bet体育电竞eLife.51779.sa1

作者的反应

必要的修正:

1)关于Tgfb途径的药理学和遗传抑制的证据很少,尤其是在使用化学抑制剂的剂量下。报告ScxCreERT2/RosaT小鼠的标记特异性需要进一步验证,特别是在没有他莫昔芬的情况下可能存在的渗漏。排除假阳性积极性是必不可少的。

药物抑制

SB-431542是一种非常成熟的TGFβ抑制剂,在许多体内小鼠研究中使用,剂量范围从0.17 mg/kg到10mg/kg,可采用不同的注射方案,如口服灌胃、单IP注射或每日IP注射(见应答结束时列示的参考资料:Araujo-Jorge et al., 2012;Bayomi等人,2013;Chowdhury等人,2015;Koh et al., 2015;Lemos et al., 2015;Lu et al., 2018;Mercado-Gomez等人,2014;Miao et al., 2014;穆罕默德等人,2017; Mordasky Markell et al., 2010; Pulli et al., 2015; Sato et al., 2015; Schindeler et al., 2010; Shi et al., 2017; Tanaka et al., 2010; Waghabi et al., 2007; Wei et al., 2010; Zhang et al., 2016; Zhou et al., 2019)). We chose our dosing regimen based on this prior literature and used 10 mg/kg daily IP injections as the most commonly used, highest dose, and therefore most likely to be effective. To determine the effect of the drug on TGFβ signaling, we carried out western blotting for pSmad2/3 with carrier and SB-431542 treatment. We were surprised not to see a difference between injured tendons (carrier vs. inhibitor), however there was a significance increase in uninjured control tendons with inhibition. This suggested that the systemic level of pSmad2/3 is generally higher in those mice and we therefore normalized to the contralateral control. Once normalized, there was a ~67% reduction in pSmad2/3 with SB-431542 treatment (new Figure 2—figure supplement 1).

对照肌腱中pSmad2/3的差异可能表明SB-431542抑制或其他TGFβ超家族分子的潜在补偿的潜在反馈机制。我们还通过检测phospho-p38蛋白(TGFβ信号的非smad中介物)测试了这一结果是否针对pSmad2/3,并发现损伤或抑制剂治疗(无论是标准化还是非标准化)没有差异。根据体外研究,预计SB-431542不会影响ERK或p38信号通路(见Inman et al., 2002)。还有一个问题是我们是否选择了正确的时间(上次注射后2小时)来收集肌腱。有证据表明TGFβ信号是循环的(Zi et al., 2012);因此,该化合物每天只能抑制一定的时间。尽管我们的pSmad2/3结果有些出乎意料,但我们确实看到SB-431542具有相对抑制作用,我们的许多结果(功能检测、招募、细胞总数)都表明该抑制剂对愈合有影响。材料和方法,结果小节“TGFβ信号是功能再生所必需的”,和讨论已更新为新的图2 -图补充1。

基因缺失

原来的TGFBR2.Scx样品很难得到。在三苯氧胺治疗后,我们失去了许多窝(大约有200只老鼠),这里包括的样本是少数存活下来的。超过这条线没有帮助(我们尝试了两次),经过多年的尝试,我们在2019年初,也就是本手稿初次提交之前,取消了这条线。因此,我们无法产生新的小鼠用于实验,我们检查了剩余的冷冻切片,并尝试对pSmad2/3进行免疫染色(无效)和对TGFBR2进行免疫染色。我们现在纳入TGFBR2的结果显示TGFBR2在TGFBR2中的免疫染色减少Scx突变体与三苯氧胺治疗(新的图3 -图补充2,小节“损伤后细胞募集需要新生腱细胞TGFβ信号”)。

报告者ScxCreERT2/RosaT小鼠的标记特异性需要进一步验证,特别是在没有他莫昔芬的情况下可能出现的渗漏。

1岁时未注射他莫昔芬的ScxCreERT2/RosaT/ScxGFP小鼠分析显示RosaT+细胞不存在,提示无渗漏。我们选择在我们的殖民地中维持的最老的年龄,以跨越最宽的时间范围,使渗漏可能发生。这现在包括在图3 -图补充1(小节“新生儿腱细胞中TGFβ信号是损伤后细胞募集所必需的”)。

此外,目前还不清楚非scx, ScxGFP+细胞在愈合过程中也被aSMACreERT2小鼠标记。

这是一个非常有趣的观点。为了真正解决这个问题,我们可能需要沿袭两个Scx而阿斯玛这是目前不可能的,因为它们都是CreERT2细胞系。然而,如果所有ScxGFP细胞都来自aSMA,这将表明上皮细胞/副上皮细胞可能是第二个细胞来源。为了测试这一点,我们用P2、P3他莫昔芬标记和P5损伤生成了ASMACRERT2/RosaT/ScxGFP幼崽,注射和不注射SB-431542(n=2/组,尽管未治疗组中有1只小鼠ScxGFP阴性,并且没有用).不管SB-431542如何处理,d14处的所有幼崽均显示RosaT+细胞募集到间隙空间。这与我们的aSMA免疫染色一致,表明aSMA细胞在d3处不受SB-431542处理的影响。我们发现aSMA细胞由大多数非ScxGFP细胞和一部分(但不是全部)ScxGFP+细胞组成(新图8-图补充3)。由于aSMA标记了一些原始腱细胞(图8-图补充2),我们仍然不能完全排除aSMA+/ScxGFP+细胞也是Scx.结果和讨论已经进行了相应的修改,添加了新的图8 -图补充3。(见Non-Scx分段”新生肌腱细胞也有助于新肌腱的形成”。

2)另一个问题与功能性活性Tgfb的测量有关,并将其表示为总Tgfb的比例。这是因为TGFβ通过潜伏期相关蛋白(LAP)表达,通过掩盖许多不同组织(包括肌腱)的细胞外基质(ECM)使其失去活性。TGFβ没有功能,除非它被激活。因此,肌腱组织中TGFβ的mRNA水平(图1)并不反映TGFβ信号通路的激活。应测量活性TGFβ/总TGFβ比值。

我们使用ELISA检测了活性和潜在的TGFβ1,发现损伤后总TGFβ1水平升高,活性TGFβ1没有变化。虽然长期以来人们认为TGFβ在不释放潜在复合物的情况下不能发出信号,但《细胞》杂志最近发表的一篇有趣的论文表明,潜在的TGFβ也可能通过整合素αvβ8的结合发出信号(Campbell et al., 2020)。也有可能大多数信号是由TGFβ3介导的,我们无法检测,因为小鼠TGFβ2和TGFβ3 ELISA试剂盒要么没有商业可用,要么没有验证组织裂解液(与TGFβ3试剂盒制造商讨论过)。然而,我们确实发现pSmad2/3信号通路增加,这表明损伤时信号通路活跃。我们现在包括细胞参考和更新的材料和方法,结果小节“TGFβ信号在新生儿损伤后被激活”,和讨论。

3) Smad2/3磷酸化的western蛋白需要复制和定量,以确定靶点的参与和抑制。

pSmad2/3的Western blot现在包括使用新收集的样本,并按要求进行量化(更新图1,分段“新生儿损伤后TGFβ信号被激活”)。

4)为了提高清晰度和巩固结论,需要有关扩散和迁移的新数据。建议采用体外细胞增殖试验。同样重要的是,作者定量的增殖细胞,并提出这些总%的增殖细胞。同时进行划痕分析来评估迁移将是一个有价值的补充。

我们同意审稿人的观点,TGFβ的增殖作用可能会使划痕实验的解释复杂化。首先,这些细胞在检测前确实是缺乏血清的,现在更新的方法反映了这一点(我们为遗漏而道歉)。然而,在血清饥饿的情况下,EdU染色显示有一定程度的增殖发生。因此,我们现在加入了要求的实验,重复划痕试验和定量增殖,以确定增殖和迁移是否以任何方式耦合。我们的结果显示,添加TGFβ1可以增强间隙闭合,但增殖没有显著差异(更新图5,小节“TGFβ信号对tenocyte迁移是必需的,但不增殖”)。

最后,作者应该检查TBR2缺乏的胎癣菌中的迁移,以进一步支持腱鞘内效应。

如上所述,Tgfbr2螺旋线在我们的菌落中不再可用。为了确定培养模型中腱细胞的固有效应,我们使用ScxCreERT2标记细胞,并分析标记细胞在培养皿中的行为。定量分析显示Scx迁移能力增强(更新图5,小节“TGFβ信号在tenocyte迁移中是必需的,但不需要增殖”)。

其他需要解决的问题:

1)考虑到ScxGFP构建物比内源性Scx表达模式更广泛,Tmx标记应在~D7-10损伤后确认ScxGFP和ScxAi4细胞重叠。

由于实验室关闭,我们无法进行这个实验,但ScxGFP更广泛的表达模式是一个很好的和重要的点;我们现在已经将此作为讨论点。这也可能反映了不完全重组(尽管我们确实看到~96%的ScxGFP+腱细胞在对侧对照肌腱中重组)。

2) ScxGFP细胞募集减少是否也发生在TβR2中,这是一个问题Scx老鼠?这可能需要更详细的研究。

不幸的是,许多TGFBR2Scx收集的样本没有ScxGFP(这包括所有的d14样本)。我们在第28天收集了2个突变体样本(原始手稿中没有包含),显示尽管Scx极少,但仍存在ScxGFP细胞细胞招聘。鉴于asmacreert2的新结果,可能是这一人口(至少部分)来自Asma细胞。这现在包括在图8 -图补充1和结果小节“非scx”中新生肌腱细胞也有助于新肌腱的形成。

3)图3和图4中rosat标记细胞之间的明显差异需要解决。图3B和C中“在sb -431542处理的肢体中检测到很少的RosaT信号”和“很少的Scx”TβR2中检测到腱细胞Scx然而,有许多红色的Scx示sb -431542处理的腱细胞(图4B'和B')和TβR2Scx突变体肌腱。这种差异的原因是什么?

图4显示了d3处肌腱末梢受损边缘的切片,我们可以看到原始腱细胞(高度标记)在d3处增殖。图3来自于第14天的中间物质(前间隙),我们在这里量化招募(所有标记的细胞都必须迁移到间隙中)。我们在修订的文本中澄清了这一点(添加了“中间物质区域”和“损伤肌腱边缘”来描述横切面的位置(小节“损伤后细胞募集需要新生腱细胞TGFβ信号”)。

4)图7中,TGFβ配体在SB-431542处理的损伤小鼠中减少。作者的结论是,TGFβ信号通路对于损伤时TGFβ配体的上调是必需的。这个结论令人困惑。

相对于承运人受伤的群体,它是下降的,但不是对非受伤的控制。我们将此解释为,正常情况下,损伤后,切割部位d3处TGFβ配体增加。在TGFβ抑制下,没有观察到增加(SB-431542损伤组与载体或SB-431542非损伤组没有区别)。虽然从d3抑制剂治疗的队列中获得TGFβ1 ELISA数据也有助于支持这些数据,但我们目前无法产生额外的小鼠。此外,由于这种增加是特定于肌腱局部区域的,由于将整个肌腱裂解液结合起来并用于ELISA,因此尚不清楚是否能检测到差异。

5)作者先前发现成人愈合中腱细胞募集不足,但新生儿中腱细胞募集适当——这是大小/距离的函数,因为其他多个模型显示了桥接组织,还是这是AT的特殊发现?

我们测量了相对于对侧肌腱原始几何形状的间隙,发现新生儿和成人之间的相对间隙没有差异(事实上,相对于长度的间隙在新生儿中可能略大)。由于目前的研究不包括成人伤害,我们仅将这些数据显示为作者反应图1.我们假设横断损伤没有修复在成人中造成了一个临界大小的缺陷,而成人腱细胞不能弥补这个缺口,而新生儿腱细胞可以。Loiselle博士实验室的出色研究观察到,当肌腱末端被缝合时,屈肌腱的成年腱细胞成功桥接,这表明,成年腱细胞募集可能存在一个间隙距离阈值。注意,虽然成人间隙空间没有被Scx占据Tenocytes,桥接纤维饲料瘢痕组织在D14处高度Asma +。由于审稿人的建议,从染色博士的工作表明,此前也可能存在特异性差异,以前表明髌骨肌腱缺陷由寄生虫细胞桥接而没有内在胞胎细胞的显着活性(然而,没有进行全转化).Chris Mendias组博士的单细胞RNAseq数据也显示出特定鼠标肌腱之间的显着转录差异;这些差异可能导致不同的愈合响应。由于此稿件不包括来自成人伤害的任何数据,因此我们不包括对与成人肌腱伤害模型相关的这些点的广泛讨论,但希望这一响应解决了审查员的问题。

作者反应图1

6)图3D:作者将抑制剂处理过的动物中TdTomato+细胞招募#的巨大变化归因于什么?这些数据还应作为桥接组织中总细胞的百分比进行分析。这将证明抑制是否影响所有细胞募集,或具体到Scx

为了确定这种变异是由于单个异常值还是愈合中的自然变异,我们获得了更多的ScxCreERT2/RosaT小鼠(n=2 Carrier和n=1 SB-431542)。虽然治疗组之间的差异现在是显著的(p<0.05),但Carrier治疗组的差异仍然存在。因此,我们认为这仅仅是由于愈合过程中的自然生物变异。现在也包含了以百分比表示招聘的新图表,我们感谢审稿人的建议。有趣的是,我们发现SB-431542处理和Scx使总DAPI细胞减少细胞募集一旦正常化就不再不同。然而,TBR2组的总DAPI与WT和归一化Scx无差异招聘仍然是不同的。这向我们提示,在Tgfbr2突变体中,有非scx的补偿性募集细胞Scx细胞没有被招募。然而,SB-431542处理没有发生补偿,总DAPI降低。我们现在更新了Results小节“新生儿腱细胞中TGFβ信号是损伤后细胞募集所必需的”、Discussion和图3。

7)图4:除了对载体和WT进行Edu标记的归一化,增殖细胞的总%还可以了解Tgfb抑制或缺失对一般细胞动力学的影响。

请求的数据现在包括在内。新数据表明,尽管ScxSB-431542处理不影响细胞增殖,无scx增殖在d3时细胞数量可能减少(p=0.07), Tgfbr2Scx突变体不受影响。结合我们在第14天DAPI量化的新结果,这表明非scx的减少第14天的细胞可能部分源于早期增殖减少。结果小节“TGFβ信号通路对于tenocyte迁移是必需的,但不需要增殖”和图4已经更新。

8)补充图3/图7:TGFb配体染色强度如何量化?因为我认为作者的主要观点是存在空间差异,所以将这些数据放在同一个图表上,并从间隙空间获得具有代表性的图像是合适的。另外,7A的两种不同色斑(紫色/绿色)是什么?理想情况下,通过ELISA定量分析配体水平将是最有说服力的,但我认识到这在技术上的挑战。

在ImageJ中量化染色强度,以获得感兴趣区域的平均强度。在肌腱中,根据ScxGFP信号选择感兴趣区域。在d3处没有ScxGFP信号的间隙空间,基于DAPI选择感兴趣区域。图像现在已经更新,以显示具有代表性的选定区域。根据审稿人的建议,我们现在将数据包含在同一个图表中,同时也包含了来自间隙空间的代表性图像(更新的图7)。绿色(ScxGFP)和紫色(tgf β1,2,3)信号现在也被清楚地标记了。

图7中我们还提供了d14活性TGFβ1的ELISA结果。我们希望能够检测总TGFβ1,但没有足够的蛋白质。(见结果小节“损伤肌腱中TGFβ配体的增加依赖于TGFβ信号”)。

9)已知TGFb可刺激培养细胞增殖。似乎细胞在划痕试验之前并没有血清饥饿,或者在其中一组中没有添加增殖抑制剂(如丝裂霉素C)。因此,很难确定这些变化是由于迁移还是增殖造成的。用Tgfbr2 cKO细胞做划痕实验,这也将是一个更好的平行于体内研究的方法。

细胞在划痕试验前血清饥饿。我们很抱歉在材料和方法(现在包括在内)中遗漏了这个细节。我们现在重复了这个实验,在划痕实验中包括了增殖的EdU定量。由于我们不再有Tgfbr2的floxed line,所以我们无法进行推荐的实验。然而,为了区分腱细胞与非腱细胞/上皮细胞迁移/增殖,我们在实验中加入了ScxCreERT2标记,并对这些细胞进行了量化。请注意,Scx细胞在P2、P3处被标记为在P7处收获的正常和非损伤肌腱,用于培养试验。材料和方法,结果小节“TGFβ信号通路对于tenocyte迁移是必需的,但不是增殖”,和图5已经更新。

10)本文不建议将aSMA+细胞仅称为肌成纤维细胞。其中一些可能是肌成纤维细胞,但不是全部。尽管aSMA是肌成纤维细胞的标记物,但所有表达aSMA的间充质细胞都不是肌成纤维细胞。aSMA在促进组织愈合的祖细胞群扩展过程中表达。这些细胞继续分化为ScxGFP+细胞、骨细胞、纤维软骨和成牙细胞。另一方面,肌成纤维细胞是一种更成熟的细胞类型。肌成纤维细胞的关键定义特征是体内应力纤维和收缩力的重新发展。含有aSMA的应力纤维产生更高的收缩力,这就是为什么肌成纤维细胞表达aSMA。尽管TGFb是肌成纤维细胞的有效诱导剂(如讨论的第三段所述),但SB-431542在早期阶段并没有抑制aSMA的表达,这也表明这些细胞可能不是肌成纤维细胞。

这是一个临界点,我们完全同意。文中的语言进行了修改,删除了对肌成纤维细胞的讨论,并对aSMA进行了新的讨论细胞包括(讨论)。

11)建议作者在主图中添加未受伤的肢体,而不是图2 -图的补充1。面板A和面板B的四肢没有受伤,这样可以很好地平衡画面。

未受伤的肢体被添加到图2中。

12) 图4C–这将有助于在图表上指出Scx的扩散细胞是报道。

该图表已按建议更新。

13)图6 -图补充1 - sb -431542处理组在D14时aSMA染色是否更高?这可能进一步支持治疗组的愈合减弱/延迟。

我们回到我们的图像并使用DAPI定量染色来选择感兴趣的区域。令我们惊讶的是,我们发现SB-431542治疗组确实存在差异。我们还定量了Tgfbr2的aSMA染色ScxD14的突变体,发现没有差异。这现在包含在文本和更新的图6-figure补充1中,我们感谢审阅者此建议(小节“非SCX成腱细胞也有助于新腱的形成”)。

14)图7和图8的标题相同。

图8的标题已经更正,谢谢(小节“Non-Scx”)成腱细胞也有助于新腱的形成”)。

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https://doi.org/10.7554/188bet体育电竞eLife.51779.sa2

文章和作者信息

作者详细信息

  1. 迪帕克一个个性

    美国纽约西奈山伊坎医学院骨科系
    捐款
    概念化,数据管理,形式分析,资金获取,验证,调查,可视化,方法论
    竞争利益
    没有宣布相互竞争的利益
    ORCID图标 "此ORCID iD标识本文作者:"0000-0002-0470-3219
  2. 克里斯汀L豪厄尔

    美国纽约西奈山伊坎医学院骨科系
    捐款
    数据管理,形式分析,调查,方法论
    竞争利益
    没有宣布相互竞争的利益
  3. Zerina Balic

    美国纽约西奈山伊坎医学院骨科系
    捐款
    数据管理,形式分析,方法论
    竞争利益
    没有宣布相互竞争的利益
  4. 德克Hubmacher

    美国纽约西奈山伊坎医学院骨科系
    捐款
    概念化,资源,数据管理,形式分析,监督,资金获取,调查,方法,写作-审查和编辑
    竞争利益
    没有宣布相互竞争的利益
    ORCID图标 "此ORCID iD标识本文作者:"0000-0003-1569-9451
  5. 爱丽丝H黄

    美国纽约西奈山伊坎医学院骨科系
    捐款
    概念,资源,形式分析,监督,资金获取,调查,方法,项目管理
    为对应
    alice.huang@mssm.edu
    竞争利益
    没有宣布相互竞争的利益
    ORCID图标 "此ORCID iD标识本文作者:"0000-0002-5037-6829

资金

国家卫生研究院(R01AR069537)

  • 爱丽丝H黄

国家卫生研究院(F31AR073626)

  • 迪帕克一个个性

国家卫生研究院(R01AR070748)

  • 德克Hubmacher

资助者不参与研究设计、数据收集和解释,也不参与提交作品出版的决定。

致谢

NIH/NIAMS R01AR069537对AHH、F31AR073626对DK、R01AR070748对DH资助。

道德

动物实验:本研究进行了严格按照指南中建议的实验动物保健和使用美国国立卫生研究院和所有程序批准的机构动物保健和使用委员会(IACUC)在西奈山(IACUC - 2014 - 0031)。

高级编辑

  1. 克利福德·罗森,美国缅因州医学中心研究所

检查编辑器

  1. 莫尼·扎伊迪,西奈山伊坎医学院,美国

评论家

  1. 美婉,美国约翰霍普金斯大学医学院
  2. Alayna E Loiselle,美国罗彻斯特大学医学中心
  3. 美国宾夕法尼亚大学

出版历史

  1. 收到:2019年9月11日
  2. 录用日期:2020年6月4日
  3. 接受的手稿发表:2020年6月5日(版本1)
  4. 出版版本:2020年6月29日(版本2)

版权

©2020,Kaji等。

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