1. 细胞生物学
  2. 免疫学和炎症
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通过模式感知鉴定鼠狼疮超功能tfh样亚群

  1. 斯蒂芬妮Gryzik 是通讯作者
  2. 日元黄平君 是通讯作者
  3. Timo Lischke
  4. Elodie莫尔 是通讯作者
  5. 梅勒妮文兹克
  6. 伊莎贝尔Kadner
  7. 约瑟芬Poetzsch
  8. Detlef Groth
  9. Andreas Radbruch
  10. Andreas Hutloff
  11. 鲍姆格拉斯酒店 是通讯作者
  1. 德国风湿病研究中心(DRFZ),莱布尼茨研究所,德国
  2. 德国波茨坦大学
  3. Charité, Campus Mitte,德国
研究文章
提及这篇文章为:188bet体育电竞eLife 2020; 9: e53226 doi:10.7554 188bet体育电竞/ eLife.53226

摘要

T细胞的失调细胞因子表达在自身免疫疾病的发病机制中起着枢转作用。然而,相应的致病性亚步骤的鉴定是一种挑战,因为在蛋白质标记表达中的生理变异和新品质之间的区分需要组合评估。在这里,我们能够通过我们的分纳方法“免疫细胞(PRI)的模式识别”,鉴定狼疮易一点小鼠的超功能性卵泡辅助T细胞(TFH) - 蜂窝卵泡。pri揭开了IL-21的亚型+IFN-γ.高的PD-1CD40L高的CXCR5-Bcl-6-T细胞在患病小鼠中特异性扩增。此外,这些细胞表达高水平的TNF-α和IL-2,并以IL-21和CD40L依赖性的方式为产生IgG提供B细胞帮助。这种超功能T细胞亚群可能是自身免疫过程的一个优越驱动因素,因为它具有多功能和高细胞因子表达,并具有tfh样特性。

介绍

CD4 T细胞在自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮(SLE))中发挥着重要作用,它作为自体反应性疾病促进记忆细胞积累,并放大炎症,以及提供B细胞帮助(Suárez-Fueyo等,2016).众所周知,细胞因子产生失调、代谢改变和细胞信号异常会导致T细胞分化异常和B细胞过度激活,从而导致狼疮(Moulton等人,2017年).对于SLE,有几项小鼠模型和人的研究表明,病情的进展与TNF-α、IFN-γ和IL-2的低表达有关(Humrich等人,2010年)以及PD-1的高表达(Jiao et al., 2014),IL-21(Wang et al., 2014)、IL-10 (Facciotti等人,2016年).尽管可以检测到这些单独的参数,但对SLE中t细胞亚群的综合组合特征仍然缺乏。

最近的文章揭示了T细胞亚群的巨大和意外的异质性和复杂性,细胞亚群的部分属性和功能重叠,如滤泡T辅助细胞(Tfh)和Tfh样细胞亚群(Trüb等,2017黄等人,2015年黄等人,2016).特别有趣的是最近观察到的人类T外周辅助细胞(Tph),它在自身免疫性疾病中扩展(Bocharnikov等人,2019年克里斯托弗森等人,2019年Ekman等人,2019年饶等人,2017).这些研究和其他研究表明,一方面,从多维细胞分析数据获得新的生物学见解的巨大潜力。另一方面,它们揭示了对新的分析和可视化方法的巨大需求,特别是在明显同质的亚种群中识别小但不同的特征,这是许多评论文章(Kvistborg等人,2015年Mair等人,2016年Newell和Cheng, 2016sayys等人,2016年).当前的大多数分析策略都基于集群和集群的各自频率(Levine et al., 2015邱等人,2011年Spitzer等人,2015年黄等人,2016).这些方法的主要问题是,它们倾向于发现主要的细胞群,这些细胞群在表型对比中显著高。如果细胞亚群非常相似,甚至部分重叠,如目前的研究,那么聚类方法通常不是很有意义(Newell和Cheng, 2016奥尼尔等人,2013年sayys等人,2016年).

为了解决这个问题,我们开发了基于bin的“免疫细胞模式识别(PRI)”策略。PRI是一种可重复分析和可视化方法,以检查蛋白质的组合表达模式的类似细胞亚群的混合物。在这里,我们将PRI与来自NZBxW F1小鼠(一种常见的狼疮模型)的Th细胞的综合细胞测量相结合。我们的研究结果为以IL-21为主要特征的超功能Th细胞亚群提供了证据+IFN-γ.PD-1肿瘤坏死因子-α- 2, tfh样细胞的功能特性。

结果

基于免疫细胞模式识别(PRI)的多参数流式细胞术数据可视化方法的介绍

分析致病性记忆Th细胞亚群(CD4+CD44+细胞(Swain,1994年),以下称为Tmem细胞),我们使用了NZBxW小鼠模型,这是建立得最好的人SLE模型之一,并可视化了老龄患病小鼠脾脏T细胞的三种蛋白组合(慢性炎症,高蛋白尿)。我们使用常规工具绘制了Tmem细胞IFN-γ和TNF-α的表达,如等高线图(图1一个),饼状图(图1 c)、堆叠条形图(图1 d),以及最近由FlowJo开发的工具“点的颜色映射”(图1 b).正如预期的那样,IFN-γ几乎完全由CD44产生+细胞(图1 d).

PRI允许组合蛋白表达的可视化。

采用常规方法或bin图分析了NZBxW小鼠刺激(PMA/离子霉素)脾T细胞的流式细胞术数据。(一种) IFN-γ覆盖层+所有T细胞上的细胞(B.) FlowJo的彩色图谱显示IFN-γ的MFI。(C, D) TNF-α、CD44共产生的频率+和IFN-γ被描述为类别(C)及个别组合(D.).(E.对于bin图,TNF-α和CD44的x-y平面被划分为大小相等的小bins (asinh = 0.2)。如果一个容器包含最小细胞数(10),则计算IFN-γ的统计特征,如细胞密度(左)、频率(中)或MFI(右)。特征的尺度用伪颜色代码表示。(F)仅在产生IFN-γ的细胞(左)中IFN-γ的相对平均表达水平(MFI+),在IL-2中IL-2的相对平均表达水平+(中间)和PD-1中的PD-1+细胞(右)。灰色的箱子里装有少于10z的物品+细胞。数据代表一只年老的患病小鼠(f).(E, F)每个象限的细胞频率由每个样本的细胞数(黑色)和Z的数量计算+每个样本的单元格(绿色)。数据代表三个独立的实验(C、E)n=每组4只小鼠。

通过在TNF-α的x-y平面上绘制IFN-γ表达的不同特征的热图,我们用PRI可视化工具证实了这一事实vs。CD44 (图1 e).为此,x-y平面被分成大小相同的箱子。由此产生的地块称为bin地块。根据bin,我们计算并描绘了以下特征:(i)细胞密度,(ii) IFN-γ产生细胞的频率(%),(iii) IFN-γ的平均荧光强度(MFI),以及(iv) IFN-γ的相对表达水平,仅以IFN-γ的平均荧光强度计算+细胞(MFI+ (IFN-γ))图1 f).显然,我们的bin图比较显示IFN-γ表达水平最高的是TNF-αCD44+图1 f),并处于低细胞密度和IFN-γ低至中频的区域(图1 e).这样的信息不能从传统的地图中提取出来。

接下来,我们使用PRI进行“伪多参数观察”,通过在同一x-y平面上对同一样本(老年患病的NZBxW小鼠)的不同参数进行颜色编码。这显示了IFN-γ最高bin区域含有IL-2含量高但PD-1含量低的细胞(图1 f).PRI的应用伪多参数观察不仅以易于理解和全面的方式,而且在可复制的基础上,支持具有特定或独特特性的特定亚群的发现和表征。

疾病动力学显示随后的多功能记忆T细胞减少

尽管人们怀疑抑制性受体(如PD-1)和细胞因子的组合表达对免疫的重要性(McKinney等人,2015年),据我们所知,目前还没有与CD4共同表达的全面研究+单细胞蛋白水平的T细胞治疗SLE。

为了描述狼疮发展的疾病动力学,我们根据年龄和蛋白尿对NZBxW小鼠评分(图2一个),测定自身抗体浓度,分析PD-1和CD4中四种主要细胞因子的表达+Tmem细胞。PD-1频率增加+和il - 10+以及IL-2频率的降低+和肿瘤坏死因子-α+细胞与年龄和疾病有关(图2 a - c).在疾病过程中,细胞因子的共同产生发生了变化,多功能性程度较低,可见非产生细胞和IFN-γ单一产生细胞的积累(图2-Figure补充1).

PD-1中细胞因子共表达改变+年轻和年老老鼠的T细胞。

一种)根据年龄和蛋白尿(PU)对NZBxW小鼠的病情进行评分。疾病评分与PD-1频率相关+T细胞和血清抗ds- dna - igg抗体水平。(B.)直方图叠加(顶部)和统计分析(底部)显示的蛋白质表达的疾病相关变化。(C) PD-1的代表性浇口方案-, PD-1和PD-1亚种群在CD4+CD44+疾病小鼠的T细胞得分分别为1和5。(D.)统计分析疾病评分为1(浅灰色)和5(深灰色)小鼠PD-1亚群中IL-2、TNF-α、IFN-γ和IL-10产生者的频率。(E.) TNF-α的频率+PD-1细胞+IFN-γ.+疾病分1和5的亚群体。(F)疾病评分1和5分的代表bin图,PD-1 (x轴),IFN-γ (y轴)分别显示每个bin中TNF-α、IL-2和IL-10的频率。截止为PD-1单元格用虚线标记。数据代表两个独立的实验(一种),每分n = 2只老鼠,(B-F)每组6-7只。样本比较采用Mann Whitney检验(B.),具有与Geisser-Ementhouse校正和Dunnett的多途径的双向ANOVA进行双向ANOVA(D.)和双侧非配对t检验(E.).数据以平均值±SEM表示。

由于多函数的损失被认为是慢性感染的标志,并且通常用作评估CD8耗尽的终点+和CD4+T细胞(Larsen等人,2012年Tilstra等人,2018年),我们研究了四种细胞因子与PD-1的组合表达。

PRI有助于长期激活的T细胞的组合特性

我们将疾病评分分为1-2为“年轻”,3-5为“老年病变”,并使用组合分析对这些评分进行比较。根据有关慢性感染的刊物(黄等人,2016年),我们将PD-1表达分为三个范围(负(-),低到中(低),高(高)(图2 c),使用FMO控制和IL-2表达功能缺失,绘制常规分析图表(图2D和E)及PRI可视化(图2 f).在狼疮性肾炎的疾病进展中,抑制受体PD-1的高表达与较低的CD4水平相关+与IL-2、TNF-α和IFN-γ表达有关的tmems细胞功能(图2d -图补充2A和B).在比较PD-1时,这一点得到了强调+(低和高)和PD-1-评分5的小鼠细胞群:PD-1中IL-2-和TNF-α产生细胞的频率较低,但IFN-γ-和il -10产生细胞的频率较高+细胞群(图2f -图2B-D).TNF-α的频率+IFN-γ内的Tmem细胞+PD-1+CD4+狼疮肾炎亚群减少(图2 e),类似于CD8+慢性感染中的Tmem细胞(Utzschneider等人,2016年).

与饼图(图2 -图补充2E), bin图的伪多参数查看允许比较整个模式(频率和表达水平)和不同细胞因子的bin区域,颜色标绘在同一x-y平面上。显然,在IFN-γ中PD-1-/低TNF-α和IL-2的表达频率和表达水平最高,但几乎不产生IL-10 (图2f -图2C和D的补充).等高线图证实IL-10、IL-2和TNF-α低共表达(图2 -图3A补充).与PD-1亚组的常规分析相比(图2d -图2A, B和E的补充), PRI较高的组合复杂性使得能够识别更多信息的亚种群,如PD-1IFN-γ.细胞(图2f -图2C补充).

显然,bin图中三个参数的组合模式(Bendfeldt et al., 2012)支持一个更结实性的陈述,而不仅仅是在后续的门控之后确定象限的频率,这显示了我们的半连续bin绘图的特殊力量。这也许可以解释Kasagi等人的相反结果,他们报告“PD-1中IFN-γ水平较高”比PD-1NZBxW患病小鼠的CD4细胞+人口(Kasagi等人,2010年).

以IL-10的组合表达为例,显示了可重复性和统计上可靠的bin图模式

我们发现IL-10有类似的bin图模式(与PD-1相关的更高频率IFN-γ.尽管在每只小鼠的IL-10表达频率和疾病评分(图2 -图3B和D),甚至把不同实验中的小鼠连在一起(各三只小鼠)(图2 -图3C补充).使用IL-10 bin图,我们还展示了PRI方法的一些总体优势:(i)改变IL-10的截止值+细胞对IL-10频率有很高的影响,但对它们的bin模式几乎没有影响(图2 -图补充3E).(ii)绘制的每箱10个单元的货柜面积提供了统计上可靠的数据,这可由相对平均标准误差(RSEM)显示(图2 -图补充3F).(iii)比较不同样本的IL-10表达,这里不同的供体小鼠、不同的实验和不同的疾病评分,由于它们的bin模式相似,很容易实现。

Bin的阴谋显示了一架IL-21+超功能T细胞亚群

近年来,在SLE患者的Tmem细胞中发现IL-10与IL-21高度共表达(60%)(Facciotti等人,2016年).因此,我们在NZBxW T细胞的组合表达研究中加入了IL-21的测量,这导致了32种可能的组合,共产生5种细胞因子(图3 -图补充1A).相反Facciotti等人,2016年,然而,在NZBxW小鼠中,我们观察到IL-10和IL-21在常规等高线图中没有大量共表达,在TNF-α和IFN-γ平面的bin图中也没有强烈重叠的bin区域(图3A和D).相比之下,IL-21尤其与IL-2和TNF-α共同表达如等高线图和bin图所示,分析两个(图3一)、三(图3 d)或四种细胞因子(图3 e同时)。

在NZBxW模型中,大多数IL-21产生者强烈共同表达Th1细胞因子,但不表达CXCR5。

一种) IL-21与细胞因子及Tfh标记物PD-1和CXCR5在CD4级联中的协同生成+CD44+年轻和年老的病鼠的细胞。(B.)根据PD-1和CXCR5的高表达,鉴定Tfh细胞。(C) IL-21的统计学分析+从Flowjo提取的亚步骤。(D、E通过bin图分析细胞因子共产生,显示IL-21的频率+, - 2+,IL-10+D.), 2+IL-21+细胞(E.).绿色数字表示IL-2出现的频率+IL-21+每个象限的所有细胞的双生成细胞(E.).(F、 G)与PD-1 (x轴)、IFN-γ (y轴)连接的青年和老年病鼠的Bin图显示IFN-γ+和IL-10的细胞密度和频率+F)及CXCR5 (G),每箱。用斜体书写的百分比代表PD-1的种群大小IL-21+IFN-γ.+细胞。数据代表三个独立实验(a - b).(C)汇集了每组n = 4只(年轻)和n = 6只(老年)小鼠的两个实验数据。采用mann - whitney - u检验对样品进行比较。数据以平均值±s.e.m. (d)将相同实验的n = 3只幼鼠和老年鼠的样本串联。截止为PD-1单元格用虚线标记。(E.)如果一个容器包含最少数量的单元(5),则第三个标记的频率以伪彩色显示。每个象限的单元频率根据每个样本的单元数(黑色)和Z的数目计算+每个样本的单元格(绿色)。

寻找IL-21时+TMEM细胞群具有频率之间的频率差异(得分1-2)和旧患病(得分3-5)NZBXW小鼠,我们确定了IL-21更高频率的趋势+和IL-21+IFN-γ.+使用常规门控分析,老年小鼠的细胞与年轻小鼠的细胞进行比较。然而,与PD1相比,它们在统计学上并不显著Tmem细胞和CD44细胞+CD4细胞+子集(图3 c).

门为PD-1和PD-1研究表明,所有被研究的种群在老年小鼠中都有更高的频率,但只有PD-1IL-21+IFN-γ.+人口显著增加(图3 c).这些数据与PRI数据具有可比性(图3 -图补充1B),即使PD-1IL-21+IFN-γ.+幼龄和老年病鼠的种群差异无统计学意义。虽然IL-21是Tfh细胞的标志,但在NZBxW模型中,IL-21的表达与PD-1无关CXCR5+Tfh细胞表型(图3G-Figure补充1D).

显然,IL-21的频率+Tmem细胞中的细胞并不随着疾病评分的升高而发生显著变化,而是这些细胞共同产生IFN-γ和PD-1的特性(图3C和f -图补充1B和C).确定的PD-1IL-21+IFN-γ.在年轻和年老患病小鼠中,细胞亚群甚至表达了大量的IL-2和TNF-α。因此,下文将其称为超功能T (Tsh)细胞。

bin图的伪多参数查看以分析共表达性质

根据我们的经验(Fuhrmann等人,2016年)细胞因子和受体的共表达,我们进一步表征了鉴定的IL-21+IFN-γ.PD-1通过研究PD-1和IFN-γ平面上42个功能相关蛋白的bin模式(其中17个显示在图4一图4 -图补充1A和B).我们使用IFN-γ代替IL-21作为y轴上的第二个参数,因为IFN-γ的强度范围比IL-21的范围宽得多,因此更适合于显示大多数Z参数的首选表达区域。由于可重复的表达模式,PRI允许分析来自不同小鼠和实验的蛋白质。同样,PD-1IFN-γ.箱子中IL-21的发生率最高+细胞。这些箱子中的T细胞主要共同表达CXCR3和T-bet,缺乏FoxP3表达。的IL-21+表达模式仅部分与Bcl6、CXCR5或CXCR4重叠(图4a -图补充1A).此外,IL-21+IFN-γ.PD-1Tmem细胞还产生CD40L和ICOS,这两种受体参与了T细胞和B细胞的相互作用。IFN-γ产生的CD40L含量最高细胞(图4b -图补充1A).相比之下,PD-1的刺激受体ICOS、OX40、GITR和CD27的表达强度较低IFN-γ.而在Tfh (Bcl6 .)本区域。抑制受体TIGIT、CTLA4和BTLA也是如此,它们主要由Tfh细胞、长期激活的T细胞和/或Treg细胞(图4b -图补充).所有这些特性及其中到高PSGL-1表达表明具有Th1特性的Tfh样细胞亚群而不是滤泡外Tfh细胞(崔等人,2015Odegard等人,2008年).

超功能T细胞表现为Th1特征,为CD40L国际安全和发展理事会+

一种Bin图显示PD-1和IFN-γ与多种蛋白在刺激的老龄小鼠脾T细胞(PMA/离子霉素)中共表达。(B.)前50% Z的分布+来自(一种).如果一个容器包含最小的单元格数(10),则第三个标记的频率以伪颜色显示。每个象限的细胞频率是根据Z的数目计算的+象限内的细胞(红色)和Z的数目+每个样本的细胞数(绿色)。数据代表至少两个独立的n≥ 3只老鼠。

随着IL-21+IFN-γ.PD-1与其他tfh样细胞相比,Tmem细胞缺乏CXCR5的表达,我们研究了它们对IL-21的贡献+细胞(图5A和B)及其组织分布(图5 c).我们能够在脾脏和非淋巴器官、肝脏和肺中以可比频率定位它们(图5C和D).我们也可以在肾脏和外周血中检测到它们(图5C和D数据未显示)。再次,IL-21+细胞在所有这些器官中共同产生高水平的IFN-γ,但几乎没有CXCR5 (图5 d)有趣的是,患病NZBxW小鼠的Tsh细胞亚群比Tph大两倍,比Tfh细胞亚群大10倍。

外周器官的超功能T细胞的频率超过滤泡外T细胞和Tph细胞。

一种)脾脏PD-1亚群绝对值。(B.)脾脏中IL-21产生因子的频率。(C, D) IL-21生产者的本地化和PD-1子集的频率。数据代表了两个独立的实验,每个器官有4只老鼠。数据以平均值±s.e.m.表示。

PRI揭示了Tfh和Tfh-like细胞亚群之间的差异

为了更好地定义和比较Th细胞亚群的重要特性,我们用多个样本确定了bin区域的表达值。为此,我们用3 × 3网格覆盖PD-1-IFN-γ平面,根据其PD-1和IFN-γ表达水平将其分为9类(图6).这些类别内许多标记的统计分析(图6b -图补充1A)证实了Th细胞亚群的一种特殊模式(如图所示图6 d).其中包括IL-21的最高频率+PD-1中的T细胞T细胞,通过它们向CD44的正常化来证明+T细胞(图6 c),并与IFN-γ表达水平呈正相关(图6 b).

箱图案的TFH和TFH样细胞亚群的比较。

一种根据PD-1和IFN-γ的表达,将Tmem细胞细分为9类D.).(B.)描绘各个亚步骤中CXCR5,BCL6和IL-21生产商的频率的准备主。(C)各亚群体中IL-21产生者相对于CD44的频率+细胞。(D.) Treg、Tfh、Th1和IL-21发生概率最高的区域+细胞。(E.) CXCR5/Bcl6、IL21/Bcl6、IL21/CXCR5、IL21/ICOS双生产者频率代表性bin图, IL21/CD40L在老年病鼠脾T细胞中的表达。(F)老年病鼠脾T细胞中IL21产生而CXCR5不产生细胞频率的代表性bin图。(G) T细胞根据CXCR5和Bcl6的表达水平细分为阴性(-)、低表达(-)和高表达(hi)(左)。通过直方图覆盖来研究IL-21的产生(右)。(H) 3D热图显示Bcl6(左)和IL21生产者(右)的频率与PD-1 (x轴)和IFN-γ (y轴)。所有数据代表三个独立的实验(B, C), n = 3-9只小鼠和(eg), 3-11老鼠。E-F,每象限(红色)和所有CD44计算“双”产生者的频率+单元格(绿色)。灰色箱子包含的Z小于10+细胞。数据以平均值±s.e.m.表示。

利用viSNE图,IL-21的相关性+IFN-γ高表达细胞及其与PD-1的分离T细胞也可以被证明(图6 -图1B).然而,viSNE仅部分适用于昏暗的标记物,如CXCR5或Bcl6,因为它显示了所有细胞的MFI。Color Maps (FlowJo 7.2)在昏暗标记的次优颜色分布方面也有类似的问题,只代表mfi,而不是表达水平(图6 -图补充1D).相反,PRI允许计算Z的标记Z的相对表达式级别+单元格(MFI+ (Z)) (图6 -图1C).

为了进一步描述Tfh样细胞和Tfh细胞亚群,我们研究了IL-21与Tfh标记蛋白CXCR5和Bcl6以及T/B细胞相互作用受体ICOS和CD40L的共表达。再次,我们使用PRI计算阳性细胞的频率,这一次每个bin有两个定义的标记蛋白,以显示双产物乌塞尔斯(图6 e).CXCR5+Bcl6+(Tfh细胞)主要出现在PD-1的bins中而IL-21的储存箱却很少+Bcl6+,IL-21+CXCR5+甚至IL-21+国际安全和发展理事会T细胞。相反,IL-21和CD40L的共同产生与IFN-γ定位在bins中T细胞(图6 e).IL-21表达水平与Bcl6无关,与CXCR5呈负相关(图6克).

策划只有IL-21+CXCR5-cell in PRI-bins with a PD1阈值可视化Tsh和Tph细胞亚群。这些细胞大多数不是PD-1但PD-1图6 f).

IL-21与Tfh标记物表达的差异在频率(图6 h)或表达水平(图6 -图补充1E),因为每种蛋白的阳性细胞出现在不同的区域。

超级功能的T细胞为B细胞提供帮助

接下来,我们询问了已描述的tfh样细胞亚群(崔等人,2015Hutloff 2018Vu Van等人,2016年)以及指定的IL-21+IFN-γ.PD-1这里鉴定的TMEM细胞。主要区别是已经针对所有先前鉴定的TFH样亚群(包括人TPH细胞)描述的高PD-1表达(Bocharnikov等人,2019年克里斯托弗森等人,2019年Ekman等人,2019年饶等人,2017).

细胞因子的表达水平、数量和频率通常不与tfh样标记蛋白平行。除了IL-21的表达外,这里指定的和已知的tfh样细胞最重要的相似之处是CXCR5的缺失和ICOS和CD40L的表达图4A、b -图补充).这些特征促使我们研究IL-21是否+Tmem细胞可通过CD44共培养产生抗体-naive B细胞和CD44+CXCR3+非tfh非treg细胞(图7).CXCR3+在FACS活分选中作为IFN-γ产生的替代标记物,并有助于IL-21的富集+IFN-γ.与CD44相比,Tmem细胞增加了5倍+T细胞(图4一图7 -图补充).这些CXCR3的多克隆刺激+T细胞诱导B细胞产生高水平的IgG (图7 b)通过阻断IL-21或CD40L信号而降低,通过阻断两种途径而消除(图7 b).我们可以排除这些细胞高IFN-γ水平的B细胞帮助活性,如报道的IgG2a诱导(Snapper和Paul, 1987年),因为阻断IFN-γ并没有减少IgG总产生(图7 b).

超功能T细胞在与B细胞共培养时帮助产生IgG,并用激活的GL7扩增B细胞+Fas+生发中心表现型。

一种)脾细胞流式细胞术分选naïve B细胞(CD19+B220+CD44)和Th1细胞(CD4+CXCR5-CD44+CD25-CXCR3+).在存在或不存在针对B细胞激活细胞因子的抗体的情况下,两种组分共培养5天。用抗CD3和CD28的激动性抗体刺激T细胞。作为阳性对照,用IL-21和激动性抗CD40抗体刺激B细胞。用ELISA法检测上清液中的IgG。(B.) ELISA结果。给出了三个实验中的一个具有代表性的实验。采用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验进行统计分析。(C)总CD19+B220+B细胞单独(阴性对照,-)或与IL-21+抗CD40抗体(阳性对照,+)、CXCR3共培养5天+PD-1Tsh (PD-1CXCR3+)、CXCR3-PD-1CD4 T细胞(PD-1CXCR3-),或者PD-1CXCR5+/-细胞(PD-1)从2岁C57Bl/6小鼠汇集的脾细胞中提取的流式细胞术。第5天,通过GL7和Fas的共表达检测活细胞,通过CD138的表达检测生发中心(GC)样B细胞的活性。B细胞计数和活力的数据代表了每次6个重复的2次实验中的1次。GL7数据+Fas+gc样B细胞和CD138+抗体产生细胞的数据来自两个独立的实验,涉及1-7个重复。CXCR3差异有统计学意义+PD-1Tsh共培养和其他条件通过Mann Whitney检验进行评估。

为了测量TSH细胞的相对辅助功能,我们比较了它们在体外提供B细胞提供B细胞的能力(图7C-Figure补充2).我们分类(CD4+CD44+PD-1)含有CXCR5的细胞+具有完善辅助功能的Tfh辅助细胞(Vinuesa等。,2016年),TSH(CD4+CD44+CXCR5-PD-1CXCR3+),作为对照组的还有CD4细胞+CD44+CXCR5-PD-1CXCR3-亚群,与B细胞体外共培养5 d (图7 -图补充2A-B).以获得足够的T细胞,特别是PD-1在NZBxW小鼠体内代表一分钟种群的细胞(图3 c),我们采用了老的(15-24个月)C57BL/6小鼠,这些小鼠很容易获得,并且已知出现自身免疫特征(Hayashi等人,1989年Nusser等人,2014年).我们发现,这些小鼠的Tsh细胞数量也增加,共同产生高水平的IFN-γ、IL-21和CD40L (图7 -图2C补充).在共培养终点,我们通过流式细胞仪分析B细胞的数量、活力和表型(图7 -图补充2D).引人注目的是,PD-1CXCR3+Tsh细胞促进B细胞比任何其他条件下更大的扩增,甚至超过阳性对照(IL-21和抗CD40)和PD-1分别为2倍和3倍的细胞(图7c -图补充2D).但是,PD-1细胞在保存更多存活B细胞方面明显优于其他条件(图7c -图补充2D).与PD-1培养的B细胞相比,Tsh细胞培养的B细胞表型明显不同细胞。而CD138的比例+与PD-1共培养时产生抗体的B细胞较高Tsh细胞诱导33%的B细胞表达激活标记物GL7和Fas(通常用于定义生发中心(GC) B细胞),而PD-1中具有GC样表型的B细胞只有1.5%培养(图7c -图补充2D).Tsh细胞恢复的gc样B细胞比例与PD-1相似CXCR3-细胞和阳性对照(图7c -图补充2D).然而,鉴于Tsh细胞在促进B细胞增殖方面的优势,本实验表明Tsh细胞具有很强的辅助能力,与PD-1具有互补作用和B细胞分化过程中的Tfh细胞。

提示产生超功能Th细胞(IL-21+IFN-γ.PD-1Tmem细胞)是一种新的tfh样亚群,可以通过IL-21和cd40l依赖的方式为狼疮肾炎小鼠提供b细胞帮助。

讨论

对于许多自身免疫性疾病,其潜在的细胞机制仍不完全清楚。为了开发新的靶向治疗,识别潜在致病的免疫细胞亚群是很重要的。为此,适当的高维细胞数据分析和可视化方法对于记录疾病过程中免疫细胞模式的整体变化至关重要。我们的研究产生了三个重要的发现:它显示了我们的pri可视化的附加价值,它识别了一个超功能的tfh样细胞亚群,并表明其对SLE的潜在功能作用。

首先,PRI使Super-Functional IL-21的识别和表征能够识别和表征+IFN-γ.单元格子集的主要功能:(i)简单可视化三个标记的组合属性和第三个标记的不同统计属性的热图表示。图1 e图6 e);(ii)允许直接感知相关模式的半连续组合显示(例如:图3 d e);(iii)不同标记物的可重复性伪多参数显示,使亚种群可以直观地观察和比较,甚至在不同染色板的样本之间,这在聚类算法中是不适用的。图4A和B邱等人,2011年沈等人,2018)和(iv)以百分比形式利用辅助信息是通过组合方法实现的,否则只能通过进一步的控制步骤才能获得。然而,还应该注意的是,由于PRI有许多细胞和广泛的库范围,加上正确的标记组合,从图中获得有意义的信息是必要的。

PRI为可重复和可自动化的细胞分析铺平了道路,这不仅有助于基础研究,也有助于临床研究,以确定疾病机制和进展,发现生物标志物,分析治疗应答者/无应答者,并监测操纵细胞的稳定质量和有效性。此外,PRI为视觉检查提供了统计上可靠的模式图,并在具有特征工程步骤的机器学习方法中作为预期模式识别的输入。

二是功能超强的IL-21+IFN-γ.细胞亚群是一个新的tfh样亚群,不同于目前PD-1低表达所描述的亚群。与Tfh一致,Tph (饶等人,2017)和其他类tfh细胞亚群(Bubier等人,2009年Hutloff 2018Vu Van等人,2016年温斯坦等人,2016年)脾超功能T细胞为IL-21+,CD40L国际安全和发展理事会,+图4 -图补充).它们可以排除其与TFH或Uthramicular的TFH细胞的隶属度,因为大多数超功能性T细胞既不表达BCL6或CXCR5,也不是CXCR4或PSGL-1图4Odegard等人,2008年).相反,它们似乎表现出多种功能特征,如Th1和tfh样效应蛋白的强共表达,具有高激活潜能。

多功能T细胞最初被描述为在病毒感染中具有保护作用(Kannanganat等人,2007年Seder等人,2008年).然而,多功能T细胞亚群在自身免疫性疾病中被确定为致病性(Basdeo等人,2015年).以往对多功能T细胞的研究大多集中在IFN-γ上肿瘤坏死因子-α, - 2感染和免疫环境下的细胞(Mateus等人,2019年索祖罗等人,2014年Westerhof等人,2019年).与三联阳性多功能T细胞相比,超功能T细胞在IL-21、ICOS和CD40L的额外表达方面更优越以及它们显示的B细胞辅助细胞活性(图7).体外,PD-1CXCR3+CXCR5-Tsh细胞和PD-1细胞,包含CXCR5+在诱导gc样细胞和浆细胞表型方面,Tfh细胞分别表现出二分功能。与这两种CD4 T细胞亚群的趋化因子谱一致,这一结果表明,在体内PD-1CXCR3+CXCR5-Tsh细胞可在与GC并列并在CXCR3配体CXCL9富集的滤泡间隙提供帮助(Matloubian和Cyster, 2012年).在那里,B细胞变成母细胞,增殖并分化为GC B细胞,GC B细胞迁移到富含CXCR5配体的滤泡,在那里,Tfh进一步支持促进亲和性成熟和浆细胞分化(Haynes等,2007年Vinuesa等。,2016年).或者,TSH可以参与在含有外胶质的GC样反应中扩展活化的B细胞,如在沙门氏菌感染期间最近描述的(Di Niro等人,2015年).

考虑到NZBxW小鼠脾脏中T细胞和B细胞的滤泡外共定位(数据未提供)和超功能T细胞的外周定位(图5 d),我们推测它们甚至可以直接在发炎的组织中提供B细胞帮助,从而加剧组织破坏。由于它们的抑制受体的表达低(特别是PD-1,CTLA4),与TFH细胞相比,它们的活化是促进的,因为这些表达显着较高的PD-1,CTLA4,TIGIT和BTLA(图4Butte等人,2007年Walunas等人,1994年).

第三,超功能IL-21+IFN-γ.B细胞亚群可通过B细胞帮助依赖和独立作用促进SLE进展。类似于在SLE和其他自身免疫性疾病中发现的tfh样细胞(堀内和上野,2018Hutloff 2018饶,2018年Vu Van等人,2016年),超功能亚群以IL-21和CD40L依赖的方式为IgG的产生提供有效的B细胞帮助。组织驻留的Tfh样细胞被认为是“最具致病性的T细胞亚群,因为它们在淋巴细胞组织浸润的不受控制的环境中选择自反应性B细胞,并驱动p直接在受影响组织中产生致病性抗体的细胞质母细胞(Hutloff 2018).

由于它们也存在于非淋巴器官(图5)和它们的IL-21和IFN-γ共表达,超功能细胞亚群可能在激活诱导过程中具有优势,通过扩大非淋巴组织中的致病T细胞亚群和促进炎症来驱动自身免疫。这一假设得到了一些关于IL-21或IFN- γ效应的研究的支持。

IL-21是导致SLE和其他自身免疫性疾病的唯一因素,因为在小鼠中,药理学和遗传上消除IL-21信号分别使非淋巴器官的炎症停止,并保护它们免受自身免疫性疾病(崔等人,2017刘和金,2013).符合报告的IL-21介导的增殖(Zeng et al., 2007)及其自分泌和旁分泌作用(Nurieva等人,2007年)是我们观察到的IL-21+与IL-21相比,IFN-γ+双产生群体的体内增殖能力最高+IFN-γ.-,IL-21-IFN-γ+和IL-21双阴性-IFN-γ.-)群体测量Ki67表达(数据未显示)。

IFN- γ也被认为是SLE发病的关键分子(彭等人,2002波拉德等人,2013年Tsokos等人,2016年).因此,需要过量的IFN-γ产生来维持小鼠狼疮相关Tfh细胞的积累(李等人,2012年).与此相反,还有其他关于易发狼疮的小鼠的报告(Enghard等人,2006年Humrich等人,2010年),我们观察到IFN-γ频率随疾病进展无增加,但略有下降(图2),可能与所研究的Tmem和Th细胞亚群不同有关。

除了IL-21和IFN-γ超功能细胞亚群以IL-2和TNF-α高表达而IL-10不表达为特征。由于获得性IL-2缺乏在狼疮的发病机制中是一个关键的一般事件,主要导致调节性T细胞的稳态失调,因此IL-2在SLE中具有更大的保护作用而非致病作用。相应地,低剂量的IL-2治疗选择性地纠正了Treg细胞缺陷,极大地扩大了Treg细胞亚群(Humrich et al., 2015von Spee-Mayer等人,2016).相比之下,英夫利昔单抗抗tnf -α治疗迄今为止产生了不一致的结果,并没有常规用于治疗SLE (Aringer和Smolen, 2012年).IL-10具有多种作用,可抗炎、促炎。然而,在SLE患者中,与疾病相关的较高的IL-10水平被认为是致病的,它的堵塞改善了疾病(Llorente等,2000).最近,IL-10/IFN-γ共同产生致病Th细胞亚群(CXCR5)-CXCR3+PD-1)在SLE患者(Caielli等,2019年).这些细胞不同于我们的超功能细胞,主要是因为它们不共同表达IL-21,而是独立于IL-21提供B细胞帮助,并且PD-1高。

IL-21和IFN-γ的瞬时共表达已经被描述为早期Th1-Tfh和生发中心Tfh细胞的亚群(Fang et al., 2018Nakayamada等人,2011年温斯坦等人,2016年).然而,目前尚不清楚双重产生细胞与IFN-γ和IL-21单一产生细胞在功能上有多大差异(歌曲与工艺,2019年).在这种背景下,重要的是大多数IL-21+本研究中Tmem细胞为IFN-γ+ (图3 f;年轻:56±3%,老年病变:71±4%)和非tfh细胞(图6).在NZBxW小鼠(图5).

有趣的是,有报道称IL-21可抑制tcr诱导的Th1分化(Kastirr等人,2014年Suto等人,2006年伍斯特等人,2002年),反之,强迫表达Th1主转录因子T-bet抑制IL-21的表达(Kastirr等人,2014年).因此,慢性炎症条件可能触发IL-21和IFN-γ的特殊共表达,导致细胞因子景观失调(Humrich等人,2010年)、双阳性细胞特异性扩增(Kastirr等人,2014年)和Th细胞表型的可塑性(Carpio et al., 2015).

一些报告强调了Tfh和Tfh样细胞的高度多样性和可塑性(Lüthje等,2012歌曲与工艺,2019年黄等人,2015年).Song和Craft甚至在两种原型之间提出了具有不同程度Th和Tfh细胞特征的分化细胞,这些细胞可能不存在于不同的子集中”(歌曲与工艺,2019年).他们提出寻找进一步划分Th、Tfh和Tfh样细胞亚群的替代方法。我们的PRI方法是在这个方向上的尝试,分析和可视化细胞亚群之间的连续性,而不需要通过门控进一步划分亚群(图4图3 -图补充1D).

在本研究中,我们定义了一种新的tfh样细胞亚群——超功能IL-21+IFN-γ.PD-1Tmem细胞——在细胞因子的产生数量和数量上都有优势,并提供B细胞帮助。这表明,努力降低它们的频率或控制它们的主要特性,如IL-21/IFN-γ共表达,可能是一个重要的治疗策略。

材料和方法

老鼠

NZBxNZW (NZBxW)小鼠是在德国柏林联邦风险评估研究所(Federal Institute for Risk Assessment)的动物设施中,在特定的无病原体条件下繁殖的。以雌性后代为实验对象。动物实验由柏林地方当局LAGeSo (Landesamt für Gesundheit und Soziales)批准,动物实验许可证为T0187-01和G0070/13。

每周根据蛋白尿水平(Uristix, Siemens)和体重对小鼠进行评分,监测疾病的严重程度。

C57BL6 / J小鼠购自Ganvier(法国),并在DRFZ的SPF设施中保存了15至24个月。

用于流式细胞术的细胞制备

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我们通过200µm金属网压碎脾脏分离脾细胞,以形成单细胞悬液。红细胞经低渗休克裂解,脾细胞经30µm细胞滤器过滤。

肾、肝和肺灌注PBS。从肝脏中,通过200µm金属网粉碎产生单细胞悬浮液。为了分离肝淋巴细胞,在40%Percoll存在下进行密度梯度离心,然后进行红细胞溶解。

肺、肾灌注PBS,置于冰点PBS中。将器官切成小块,用0.25 mg/ml胶原酶(Sigma)、0.25 mg/ml胶原酶D (Roche)和10 U/ml DNAse I (Sigma)在RPMI 1640培养基+ 0.5% BSA中消化。将组织通过200µm金属网轻轻压碎,然后用70µm细胞过滤器过滤。细胞在添加10% FCS、b-巯基乙醇、青霉素(100 U/ml)和链霉素(100 U/ml)的RPMI1640中洗涤重悬。

流式细胞术

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根据免疫学研究中流式细胞术和细胞分选的使用指南进行分析(cosarizza等人,2017年).

细胞内细胞因子染色:用10 ng/ml phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)和1µg/ml ionomycin (Sigma)刺激细胞1小时,然后用5µg/ml Brefeldin A (Sigma)刺激细胞3小时。在100µg/ml 2.4G2 (anti-FcγRII/III;从杂交瘤上清中纯化)以减少非特异性抗体的结合。用2%多聚甲醛固定细胞,然后用0.5%皂苷进行细胞内染色。对于转录因子的胞内染色,用FoxP3固定缓冲液(eBioscience)固定细胞,用FoxP3渗透缓冲液(eBioscience)染色。用可固定的Live / dead染色(Life Technologies)区分活细胞和死细胞。表型标记的表达用BD LSR Fortessa (BD Biosciences)和FlowJo (trestar)进行分析。

酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清抗体

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收集不同年龄小鼠血清。使用生物素标记的山羊抗小鼠IgG (γ链特异性)抗体检测(Southern Biotech) (Cheng et al., 2013).

共培养实验

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用anti-CD19-FITC、anti-CD25-PerCP-Cy5.5、anti-CXCR5-PE-Cy7、anti-CXCR3-APC、anti-B220-APC-Cy7、anti-CD4-PacB、anti-CD44-BV785、DAPI对脾细胞进行染色,并分选DAPI-幼稚B细胞(CD19+B220+CD44)和Th1细胞(CD4+CXCR5-CD44+CD25-CXCR3+),使用纯度≥95%的FACS Aria II (BD Biosciences)。Th1细胞和B细胞(2:1)在96孔圆形底板无菌共培养5天,有或没有阻断抗体:IL-21R-Fc嵌合体(R和D系统),抗cd40l(克隆MR1, DRFZ)和抗ifn -γ(克隆AN18.17.24, DRFZ)。用抗cd3(克隆KT3)和抗cd28抗体(克隆37.51,均为DRFZ)多克隆刺激T细胞。以IL-21 (Peprotech)和anti-CD40(克隆FGK-45, DRFZ)刺激B细胞作为阳性对照。5 d后,用小鼠IgG ELISA Kit (LSBio)检测上清中IgG的浓度。

用于辅助T细胞功能比较的T细胞群,从结合了PercP-Cy5.5或APC- cy7的抗pd -1、结合了PacO或BV786的抗cd44、结合了APC或BV421的抗cxcr3、结合了anti-CD4-PE、anti-CD8-Al488、DAPI或PI的脾细胞中筛选而来。B细胞纯化试剂盒采用磁珠(德国Miltenyi)富集后从脾细胞中分离B细胞,用抗b220 - fitc、抗cd19 - al647和PI染色。π-CD19+B220+B细胞,活CD4+ PD-1lo CXCR5- CXCR3+或CXCR3-和PD-1hi CXCR5+/-使用FACS Aria II (BD Biosciences)进行分类,纯度≥90%。T细胞和B细胞按上述方法培养。第5天,收集细胞,PBS洗涤,L/D水固定染料(ThermoFisherScientific)染色,并用抗b220 - fitc、抗cd4 - pe、抗gl7 - percp - cy5.5、抗fas - pe - cy7、抗cd138 - bv421染色。对于每口井,在BD LSR Fortessa (BD Biosciences)上获取细胞总数,并使用FlowJo (Treestar)进行分析。

流式细胞术分析

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文件在Flowjo中预处理(补偿,消除双峰和死池,门控)。对于Tsne,CD44+T细胞被逐渐抽出至10.000个细胞,并用Purfjo中的插件(1000次迭代,困惑20,θ0.5,eta 200)分析。对于PRI,T Cell群体被导出为FCS文件。用反双曲正弦(ArcsinH)转化荧光强度,这是流式细胞术数据的常用转化方法(Finak等人,2010年).参数x和y轴vs。Y被分为大小为0.2 × 0.2的箱子。对于每个箱子中的所有单元格,不同的统计方法被计算出来,并以颜色编码的方式绘制成热图(低值用蓝色阴影表示,中值用黄色表示,高值用红色表示)。参数Z的频率%+,参数Z的平均荧光强度+采用细胞(MFI+)、每箱所有细胞的MFI或参数Z均值的相对标准误差(RSEM)。辅助信息以黑色、红色、绿色和蓝色的百分比数字显示在每个象限。黑色百分数表示单元格相对于总单元格的频率。Z的频率+单元格是相对于各自象限内的单元格(红色),相对于总单元格(绿色)和相对于总Z+细胞(蓝色)。每箱双生产细胞(两个参数)的频率用绿色刻度标出来。所有参数都包含在分析中,小于10个细胞的箱子不显示。这个最小的细胞计数用于平衡鉴定相对罕见亚群的影响,同时保持统计上的稳健性。我们用包' flowCore '在R上操作来读取fcs文件。为了用package plotly v4.7.1生成3d曲面图,从PRI的R源代码中导出了频库表。

量化和统计分析

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使用GraphPad Prism7软件进行统计分析。对于杆和散点图,数据显示为平均值±S.E.M.统计测试包括未配对,双尾学生的T检验和Mann-Whitney测试。对于三个或更多组的比较,数据进行单向或双向ANOVA,然后进行SIDAK或Dunnett的多个比较测试(如每个数字传奇所示)。P <0.05被认为是显着的。

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    干扰素 - 伽马和系统自身免疫
    1. 公里波拉德
    2. DM Cauvi
    3. CB Toomey
    4. KV莫里斯
    5. DH河野
    (2013)
    发现药 16: 123 - 131。
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决定信

  1. 伯纳德Malissen
    检查编辑器;法国马赛艾克斯省卢米尼免疫中心Université
  2. Satyajit Rath
    高级编辑;印度科学教育和研究所(IISER),印度
  3. 乔工艺
    评论家;美国耶鲁大学医学院

为了提高透明度,eLife会发布最实质性的修订请求以及相应的作者回复188bet体育电竞。

验收总结:

一些T辅助细胞群已被证明在自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮中扩大,因此可能有助于疾病状况的揭示。为了放大那些表型与其他T细胞亚群非常相似的T细胞,作者将基于bin的“免疫细胞模式识别”策略与从狼疮易发小鼠中发现的T辅助细胞的全面细胞测量相结合。在此基础上,他们定义了一个新的超功能T辅助细胞子集,表现出优越的B细胞帮助,并可能构成治疗靶点。

同行评审决定信:

感谢您提交您的文章“通过模式感知识别小鼠狼疮中的超功能Tfh样亚群”,供188bet体育电竞.您的文章已由三位同行审稿人审阅,评估由一位审稿人和高级编辑Satyajit Rath监督。以下参与审阅您的提交的个人已经同意透露他们的身份:Joe Craft(审阅#1)。

审稿人相互讨论了这些评论,审稿人起草了这个决定,以帮助您准备修改后的提交。

简介:

作者使用最近描述的流式细胞术分析方法cytoinning来研究脾记忆CD4的表型和细胞因子表达谱+不同疾病阶段NZBxW小鼠的T细胞。该分析方法结合了传统工作流程的自动化和机器学习,将高维数据链接回两个生物标记物,这两个生物标记物可以表示为二维散点图,并能够识别免疫表型的细微变化。利用这种方法,作者确定了IL21的一个亚群+干扰素γ+PD1CD40L高的CXCR5-Bcl6-CD4+在年老的患病小鼠中,表达高水平TNFα和IL2的T细胞扩增。考虑到在共培养实验中他们观察到它通过IL21和CD40L对B细胞有帮助,作者将这一群体定义为“超功能tfh样细胞”。总的来说,这份有趣的手稿推测这些新发现的细胞对狼疮的疾病表型至关重要,包括促进自身抗体的产生。

由于该手稿的主要目的是提出一种分析流式细胞术数据的新方法,因此应该提供进一步的信息,以便将这种新方法与以前的方法进行直接比较。此外,“super-functional Tfh-like细胞”应该更准确地比T辅助(Tph energy)细胞外围,第一次描述了类风湿性关节炎的拉奥和他的同事们(Rao et al ., 2017),而今年在系统性红斑狼疮(Bocharnikov et al ., 2019),乳糜泻(Christophersen et al ., 2019)和T1DM(埃克曼et al ., 2019)。

基本修订:

1)方法论的问题。

1.1)虽然使用数据分类的组合方法揭示的见解是有趣的,但筛选数据比它需要的更具挑战性。部分面板图形标注错误(2H不存在,3C或D标注错误等),要求作者对文字和图形进行证明。同样,图2E和图2 -图补充1B几乎不可能被解析,因为颜色重叠(甚至不包括红绿分辨)。同样,某些数字也很难解释,因为灰色的阴影似乎是重叠的。考虑到装箱数据的良好可视化,这些问题更加突出。

1.2)每个PRI地块叠加来自几个样本的数据(生物重复)。虽然作者表明数据在单个小鼠中是可重复的,但对于一些标记物或一些生物学实验来说,可能会出现很大的个体间差异。提供的统计数据无法反映这个问题。应该更好地澄清如何使用PRI图来显示种群间的变异范围。

1.3)与PRI相比,本文的读者对传统的FACS分析方法更加熟悉。因此,为了建立基于PRI的定量的稳健性和对该方法的熟悉度,图3A还应包括来自年轻小鼠的样本。似乎是所有IL-21的旧小鼠的流式细胞术曲线图似乎+细胞共同表达IL-2、TNF和IFN,同时是CXCR5-、PD-1int和IL-10-.然而,相同样本的PRI评估(图3F)提供了一个可视化的表示,表明绝大多数IFNγ+细胞也产生IL-21,而在点图(图3A)中只有约1/7的IFNγ+细胞产生IL-21。此外,观察年轻小鼠的PRI,尚不清楚IL-21产生的细胞是否与老年小鼠的细胞保持相同的表型,如作者声称的(“Bin图显示IL-21”)+超功能T细胞亚群”)。除了图3F的PRI图外,图3A应该允许对年轻/年老表型的独立评估。

1.4)此外,最具生物学相关性的统计评估是关于细胞群(尽我们所能定义),而不是单个标记。如果作者声称IL-21是一个新的细胞子集的重要性+,干扰素γ+…图3E的相关统计分析应基于年轻小鼠与老年小鼠中该细胞亚群的频率,而不是(或除此之外)基于单个标记的分析。

1.5)图4所示的il -21产生细胞的表型不容易解释,IL21鉴定较差+细胞,因为它们和其他细胞一起被包含在容器中。缺乏统计数据也是一个问题。由于该手稿的一个关键目标是显示PRI与FACS分析的比较,图将改进传统的点图的门控IL-21+细胞(甚至IL21+干扰素γ++相比之下,IL-21-干扰素++对于不同的标记-在很大程度上这两个细胞群是在同一个bin区域)。然后可以提供统计数据并与PRI数据进行比较。

1.6)为什么作者没有比较IL-21的表型也令人困惑+细胞和IL-21-干扰素+和IL21-干扰素-而不是基于IFNγ和PD-1表达的复杂比较矩阵(图5、6和图6 -图补充1)。该手稿的主要目标是定义IL-21+干扰素γ+可以很容易地门控的细胞群。除了任意象限之外,还应为利息群提供数据。

图2 c 1.7)。PD-1是如何测定的-, PD-1PD-1阳性?门控不符合细胞密度图。

1.8)作者注意到这些数据是可重复的。但数据上是如何显示重现性的呢?

2)生物问题

2.1)作者只关注了“超功能tfh样细胞”,尽管在病情较重的小鼠中IL21不仅存在和扩增+干扰素γ+PD1IL21的细胞+干扰素γ+PD1高的细胞(图3E)也是IL10+干扰素γ+PD1高的细胞。来证明这个IL21+INFγ.+PD1CD40L高的CXCR5-Bcl6-T细胞群通过IL21和CD40L帮助B细胞,它们分类非Tfh-Th1类细胞(CD4+, CXCR5-, CD44, CXCR3+并检测其支持B细胞活化和Ig生成的能力。从这些实验中产生了两个主要的担忧。首先,分选策略应包括PD1,以富集mem T细胞(CD4)等非Tfh-Th1细胞+, CXCR5-, CD44, CXCR3+)在PD1内人口(CD4+, PD1, CXCR5-, CD44, CXCR3+细胞)。其次,应重复B细胞辅助试验,并与其他细胞群(包括传统的Tfh1细胞(CD4))进行比较+, PD1, CXCR5+, CD44, CXCR3+细胞),包括naïve和所有B细胞。此外,作者应该通过RNAseq对主要的三个扩展细胞亚群进行更彻底的描述,以更好地定义新型“超功能”细胞的独特性。

2.2)作者主张IFNγ+il -21产生细胞代表了一种全新的群体,不同于以往定义的具有“超功能”特性的群体。

2.2.1)有一种细胞群在人类SLE中被证明是重要的,但有一些相似之处,本文未对其进行讨论:T外周辅助细胞(Tph), Rao及其同事首次在类风湿性关节炎(Rao et al., 2017)中描述,今年在SLE (Bocharnikov et al., 2019)、腹腔疾病(Christophersen et al., 2019)和T1DM (Ekman et al., 2019)中描述。这些细胞是CXCR5-Bcl6-和IL-21产生的特点,在本手稿中讨论的种群的一个关键区别是,Tph是PD-1.然而,如果这两个群体是不同的,那么它们都应该存在。作者是否声称唯一能产生IL-21的T细胞群是新发现的?是否可以解释CXCR5中其他产生il -21的T细胞鉴别不佳-细胞,即Tph energy吗?

2.2.2)考虑到作者鉴定的超功能T细胞群与Tph细胞相似,了解超功能T细胞是否属于Blimp1将是一个有趣的问题+,这很可能是事实,认识到这种转录抑制因子在小鼠中的流动染色的潜在局限性。

2.2.3)虽然T-B细胞辅助试验为纸增加了功能组件,但如何真正的生理实验?作者是否认为他们的T细胞驱动“幼稚”B细胞在体内产生Ig?超功能性T细胞是否在次级淋巴器官或其他地方接触Naïveb细胞?NORNVEVE B细胞首先需要IgM以及TLR和/或细胞因子信号,以与活性T细胞移入接近何处?

2.2.4)利用现有信息很难解释功能分析。因为排序是用间接策略完成的(基于CXCR3+CXCR5-(T细胞)重要的是显示IL-21的频率+干扰素γ+PD-1int细胞在分类人群中。真诚CXCR5阳性对照+PD1应提供Tfh细胞,以比较Tfh和所谓的“超级功能”群体的效力。如果需要,可以提供滴定来评估相对效力。如果不与目前B细胞辅助(即Tfh细胞)的功能标准进行比较,就很难断言其具有超功能特性。考虑到产生的IgG抗体水平较低,用抗gl7和抗igg1染色的B细胞FACS图也可以使结果更令人信服。

2.2.5)通常情况下,BCR激动剂(例如抗igm)在体外检测中除了T细胞刺激外还提供(例如Sage, Nature Immunol 2016 17:1436),这可能会提高检测结果。

2.2.6)更明确的疾病定义会有所帮助。“慢性炎症、高蛋白尿”并没有那么特异性,小鼠的年龄也没有。同样,是否对自身抗体和肾脏组织学进行了评估?

https://doi.org/10.7554/188bet体育电竞eLife.53226.sa1

作者的反应

简介:

作者使用最近描述的流式细胞术分析方法cytoinning来研究脾记忆CD4的表型和细胞因子表达谱+来自不同疾病阶段的NZBxW小鼠的T细胞总的来说,这篇有趣的手稿推测这些新发现的细胞对狼疮的疾病表型至关重要,包括促进自身抗体的产生。

装箱是一种离散化数据的方法,可以通过自适应装箱(例如分位数)或固定宽度装箱(例如舍入)来完成。提到的装箱方法,首先由Roederer等人描述,2001年(Cymetometry 2001,45:37),使用基于百分位的分类。相比之下,我们的方法使用具有不同数量单元格的固定宽度分类箱。之所以选择这种可视化,是因为单元格倾向于在数据范围的中心附近聚集,但在范围的边界附近迅速变平。基于百分位的分类将强调单元格的分布。相反,我们的方法首先,我们主要关注范围边界上的表达分布和模式。我们不仅使用常规细胞计数,而且我们特别利用额外第三个或多个标记的平均荧光强度和阳性细胞频率来提供有价值的额外信息。这是3个或更多标记的cs。此外,固定宽度的装箱允许对不同样本进行良好的直观比较。

由于该手稿的主要目的是提出一种分析流式细胞术数据的新方法,因此应该提供进一步的信息,以便将这种新方法与以前的方法进行直接比较。

我们接受了这个建议,并将额外的常规分析整合到几个数字中。在图3A和图B中,我们包含了所有幼鼠的等高线图。我们对新图3F和G的bin图数据进行常规浇注分析,如图3A和B所示,统计分析结果如图3C所示。为了便于比较,我们展示了图3 -图1B中bin图的统计分析。

此外,“super-functional Tfh-like细胞”应该更准确地比T辅助(Tph energy)细胞外围,第一次描述了类风湿性关节炎的拉奥和他的同事们(Rao et al ., 2017),而今年在系统性红斑狼疮(Bocharnikov et al ., 2019),乳糜泻(Christophersen et al ., 2019)和T1DM(埃克曼et al ., 2019)。

谢谢你的推荐。Tfh和Tph细胞都具有非常高的PD-1表达(这与PD-1不同)的特点超功能类Tfh(Tsh)细胞、IL-21的高产量和CXCR5的高表达或缺失。我们包括了这三个标记物的新数据和图表(图3C下行、图3G、图3-图补充1B和图5D)。此外,我们在手稿的正文中插入了其他参考文献。

基本修订:

1)方法论的问题。

1.1)虽然使用数据分类的组合方法揭示的见解是有趣的,但筛选数据比它需要的更具挑战性。部分面板图形标注错误(2H不存在,3C或D标注错误等),要求作者对文字和图形进行证明。

对于这个错误,我深表歉意。我们修正它。

同样,图2E和图2 -图补充1B几乎不可能被解析,因为颜色重叠(甚至不包括红绿分辨)。同样,某些数字也很难解释,因为灰色的阴影似乎是重叠的。考虑到装箱数据的良好可视化,这些问题更加突出。

我们完全明白这一点。我们改进了两个饼图的颜色和图形。为简单起见,我们将饼图(以前的图2E)移动到图2 -图2E的补充)。

1.2)每个PRI地块叠加来自几个样本的数据(生物重复)。虽然作者表明数据在单个小鼠中是可重复的,但对于一些标记物或一些生物学实验来说,可能会出现很大的个体间差异。提供的统计数据无法反映这个问题。应该更好地澄清如何使用PRI图来显示种群间的变异范围。

在手稿的原始版本中,每个箱子图都显示了一只老鼠的细胞数据。为了尽量减少个体间的偏差,测量后将来自不同小鼠的数据合并在一起,并在一个箱形图中可视化。因此,在新的图3中,我们使用了来自3只小鼠(年轻和年老的患病小鼠)的连接细胞。为了示范证明该方法的稳健性,我们将新实验中连接的细胞模式与旧实验中4只单个小鼠的模式进行了比较(图2 -图补充3B)。因此我们插入了新的图2 -图补充3C。

1.3)与PRI相比,本文的读者对传统的FACS分析方法更加熟悉。因此,为了建立基于PRI的定量的稳健性和对该方法的熟悉度,图3A还应包括来自年轻小鼠的样本。

我们将常规情节的幼小小鼠包括在图3A和B中。

似乎是所有IL-21的旧小鼠的流式细胞术曲线图似乎+细胞共同表达IL-2、TNF和IFN,同时是CXCR5-、PD-1int和IL-10-.然而,相同样本的PRI评估(图3F)提供了一个可视化的表示,表明绝大多数IFNγ+细胞也产生IL-21,而在点图(图3A)中只有约1/7的IFNγ+细胞产生IL-21。

我们承认,在旧的图3F中给出的太多频率是令人困惑的。因此,我们在这里描述(作者反应图1)在小说中,图3f和g只有最重要的绿色数字(z+所有CD44的生产者+细胞在各自的象限)。

旧数据为5.7% (作者反应图1左图)及6.8% (作者反应图1右图)的CD44+细胞IL21+IFN-γ.+(DP)细胞和5.4%是三重生产者(PD-1+).大多数IFN-γ产生细胞(32%)为IL-21-和PD-1+

作者反应图1

此外,观察年轻小鼠的PRI,尚不清楚IL-21产生的细胞是否与老年小鼠的细胞保持相同的表型,如作者声称的(“Bin图显示IL-21”)+超功能T细胞亚群”)。除了图3F的PRI图外,图3A应该允许对年轻/年老表型的独立评估。

我们在图3A和G中加入了年轻小鼠的图。

IL-21的频率+和IL21+IFN-γ.+Tmem细胞(CD44+)在年轻小鼠和老年小鼠之间没有显著差异,但在老年患病小鼠中表现出略高的趋势,如PRI数据(图3-图补充1B)和FlowJo数据(图3C)所示。然而,这些细胞共同产生PD-1的特性显著增加(图3-图补充1C)。

1.4)此外,最具生物学相关性的统计评估是关于细胞群(尽我们所能定义),而不是单个标记。如果作者声称IL-21是一个新的细胞子集的重要性+,干扰素γ+…图3E的相关统计分析应基于年轻小鼠与老年小鼠中该细胞亚群的频率,而不是(或除此之外)基于单个标记的分析。

事实上,这一考虑真的是逻辑的。因此,我们提供了两项新实验(总共10只小鼠),并包括一个染色面板内的所有相关标记。这使我们允许我们在并行分析子集TFH,TPH和TSH。新图3f,g和图3-图3-数字补充1b显示了串联测量细胞的PRI数据(每个用于年轻老鼠的3只小鼠)。传统的流式细胞术分析如图3c所示。

1.5)图4所示的il -21产生细胞的表型不容易解释,IL21鉴定较差+细胞,因为它们和其他细胞一起被包含在容器中。

我们同意这一点。然而,我们发现,使用IFN-γ代替IL-21更有利于大多数z参数的首选表达区域的可视化。IFN-γ的范围远远大于IL-21的范围。因此,种群的趋势和差异可以更好地可视化,例如,CD40L强度(图4 -图补充1A)与IFN-γ强度相关。

缺乏统计数据也是一个问题。由于该手稿的一个关键目标是显示PRI与FACS分析的比较,图将改进传统的点图的门控IL-21+细胞(甚至IL21+干扰素γ++相比之下,IL-21-干扰素++对于不同的标记-在很大程度上这两个细胞群是在同一个bin区域)。然后可以提供统计数据并与PRI数据进行比较。

新图3c和新图3-数字补充1b,分别提供了通过常规门控和PRI分析获得的统计数据的直接比较。

1.6)为什么作者没有比较IL-21的表型也令人困惑+细胞和IL-21-干扰素+和IL21-干扰素-而不是基于IFNγ和PD-1表达的复杂比较矩阵(图5、6和图6 -图补充1)。该手稿的主要目标是定义IL-21+干扰素γ+可以很容易地门控的细胞群。除了任意象限之外,还应为利息群提供数据。

随后门控的结果显示在新图3c中。

图2 c 1.7)。PD-1是如何测定的-, PD-1PD-1阳性?门控不符合细胞密度图。

对于PD-1+/-我们使用FMO控制。测定PD-1高的,我们取PD-1共表达下降高的和年老病鼠的IL-2强度。

1.8)作者注意到这些数据是可重复的。但数据上是如何显示重现性的呢?

绘制相同的数据文件产生相同的模式和数字(100%相同),如果所有参数(如参数Z的定义阈值、每个容器的最小单元数和容器宽度)都保持不变。通过对参数Z (IL-10)应用如图2-figure补充3D所示的不同阈值,审稿人可以对图案的变化有一个印象。

2)生物问题

2.1)作者只关注了“超功能tfh样细胞”,尽管在病情较重的小鼠中IL21不仅存在和扩增+干扰素γ+PD1IL21的细胞+干扰素γ+PD1高的细胞(图3E)也是IL10+干扰素γ+PD1高的细胞。

是的,审稿人是对的(在新的图3C中也可以看到),IL21也有更多+干扰素γ+PD1高的和IL10+干扰素γ+PD1高的年老老鼠和年轻老鼠的细胞。然而,大部分IL-21+细胞PD-1和干扰素γ+,它定义了以前未知的子集。因此,我们集中研究这种新细胞子集的特征。

来证明这个IL21+INFγ.+PD1CD40L高的CXCR5-Bcl6-T细胞群通过IL21和CD40L帮助B细胞,它们分类非Tfh-Th1类细胞(CD4+, CXCR5-, CD44, CXCR3+并检测其支持B细胞活化和Ig生成的能力。从这些实验中产生了两个主要的担忧。首先,分选策略应包括PD1,以富集mem T细胞(CD4)等非Tfh-Th1细胞+, CXCR5-, CD44, CXCR3+)在PD1内人口(CD4+, PD1, CXCR5-, CD44, CXCR3+细胞)。其次,应重复B细胞辅助试验,并与其他细胞群(包括传统的Tfh1细胞(CD4))进行比较+, PD1, CXCR5+, CD44, CXCR3+细胞),包括naïve和所有B细胞。

为了解决这一问题,我们进行了一套新的T/B共培养试验,根据细胞的PD-1表达进行分类。

我们进行了新的T/B共培养试验,直接比较定义为CD4的Tsh细胞的B辅助能力+PD1CXCR5-CD44+CXCR3+到CD4细胞+PD1CXCR5-CD44+CXCR3-细胞和PD-1高的细胞,定义为CD4+PD1高的CXCR5+/-CD44+含有Tfh和Tph细胞的。这些实验报告见图7C和图7 -图补充2。由于Tfh和Tph种群的稀少和足够大的NZBxW F1小鼠的可用性有限,我们不得不求助于年龄(15-24个月)C57Bl/6小鼠,已知其自身免疫特征增加(见Nusser et al., 2014)。我们发现24个月大的C57Bl/6小鼠CD44数量增加+细胞和Tsh具有与患病的NZBxW F1小鼠相同的特征。对比较人群进行分类的策略以及他们各自产生的CD40L、IL-21和IFN-g如图7 -图2A和C所示。

PD-1的限制数量细胞限制了我们的研究使用定义为CD19的总B细胞+B220+单元格(图7-图补编2B)。

这些实验清楚地显示了TSH和PD-1的二象角色高的细胞。而Tsh细胞则促进B细胞更高的增殖和B细胞的gc样分化(GL7)+Fas+), PD-1高的细胞促进细胞存活,维持浆细胞更好的分化(图7C和图7 -图补充2D)。这些结果显示了Tsh细胞在帮助B细胞增殖方面的优势,现将在手稿中进行描述和讨论。

此外,作者应该通过RNAseq对主要的三个扩展细胞亚群进行更彻底的表征,以更好地定义新型“超功能”细胞的独特性。

我们同意RNAseq数据可能揭示这一新子集的额外独特标记。在这里,我们相当集中于全面的蛋白质模式(特别是细胞因子模式)特征。我们认为,该分析不仅为该子集的定义提供了独特的标记,而且还提供了独特的功能特性。

2.2)作者主张IFNγ+il -21产生细胞代表了一种全新的群体,不同于以往定义的具有“超功能”特性的群体。

2.2.1)有一种细胞群在人类SLE中被证明是重要的,但有一些相似之处,本文未对其进行讨论:T外周辅助细胞(Tph), Rao及其同事首次在类风湿性关节炎(Rao et al., 2017)中描述,今年在SLE (Bocharnikov et al., 2019)、腹腔疾病(Christophersen et al., 2019)和T1DM (Ekman et al., 2019)中描述。这些细胞是CXCR5-Bcl6-和IL-21产生的特点,在本手稿中讨论的种群的一个关键区别是,Tph是PD-1.然而,如果这两个群体是不同的,那么它们都应该存在。作者是否声称唯一能产生IL-21的T细胞群是新发现的?是否可以解释CXCR5中其他产生il -21的T细胞鉴别不佳-细胞,即Tph energy吗?

评审者是对的,在老年NZBW小鼠中Tph和Tsh两种细胞亚群均增加,并产生IL-21。为了平行于Tfh和Tsh细胞分析Tph细胞,我们进行了两个新的实验,包括CXCR5染色(见图3)。此外,我们重新分析了图5的数据,直接比较两个il -21产生亚群的频率。在NZBW模型中,Tsh细胞的数量是Tph细胞的两倍多。

2.2.2)考虑到作者鉴定的超功能T细胞群与Tph细胞相似,了解超功能T细胞是否属于Blimp1将是一个有趣的问题+,这很可能是事实,认识到这种转录抑制因子在小鼠中的流动染色的潜在局限性。

我们尝试Blimp1+染色,但没有成功。显示了一个例子,其中我们比较了PD-1获得的染色CXCR5-IFN-g+IL-21+(Tsh)细胞,PD-1高的CXCR5+(Tfh)细胞和PD-1高的CXCR5-细胞。与FMO染色相比,抗体对整个群体进行了类似的信号,包括谓的阴性TFH细胞,而T-BET染色作为对照给出差分信号。

作者反应图2

2.2.3)虽然T-B细胞辅助试验为纸增加了功能组件,但如何真正的生理实验?作者是否认为他们的T细胞驱动“幼稚”B细胞在体内产生Ig?超功能性T细胞是否在次级淋巴器官或其他地方接触Naïveb细胞?NORNVEVE B细胞首先需要IgM以及TLR和/或细胞因子信号,以与活性T细胞移入接近何处?

我们同意评论家。然而,我们希望指出,共有共有实验已经用全B细胞重复,并且TSH细胞可以帮助幼稚B细胞令人印象深刻。

2.2.4)利用现有信息很难解释功能分析。因为排序是用间接策略完成的(基于CXCR3+CXCR5-(T细胞)重要的是显示IL-21的频率+干扰素γ+PD-1int细胞在分类人群中。真诚CXCR5阳性对照+PD1应提供Tfh细胞,以比较Tfh和所谓的“超级功能”群体的效力。如果需要,可以提供滴定来评估相对效力。如果不与目前B细胞辅助(即Tfh细胞)的功能标准进行比较,就很难断言其具有超功能特性。考虑到产生的IgG抗体水平较低,用抗gl7和抗igg1染色的B细胞FACS图也可以使结果更令人信服。

一组新的共培养分析,基于PD-1和CXCR3的表达排序策略(图7C和图7 -图补充2)解决了审稿人的担忧。这项新的测试证实了PD-1的高辅助功能CXCR3+.此外,我们还对分选后的CD4 T细胞亚群中各自的细胞因子和CD40L产生进行了表征,从而使它们的特性和辅助能力之间存在直接关联(图7 -图补充2C)。这些实验提供了坚实的证据,证明Tsh细胞比Tfh具有更好的辅助能力,支持B细胞增殖,提示在自身免疫环境中产生自我反应的B细胞。

我们把审稿人的建议,分析了培养B细胞的端点我们把审稿人的建议,分析了培养端点的B细胞流式细胞仪实验(第五天),使用GL7和Fas GC-like激活细胞的标记,CD138作为IgG1的替代品来定义抗体产生细胞。我们选择CD138而不是IgG1,因为IgG1主要在Th2环境下产生,而Tph与IFN-g表现出更多的Th1表型,这诱导了不同的Ig类切换。测量IgG1可能导致低估了产生ig细胞的数量。这一新的读数突出了不同亚群提供的T细胞帮助质量的差异,但也解释了由于CD138的百分比较低,ELISA检测到的IgG水平较低+细胞。

2.2.5)通常情况下,BCR激动剂(例如抗igm)在体外检测中除了T细胞刺激外还提供(例如Sage, Nature Immunol 2016 17:1436),这可能会提高检测结果。

谢谢你的建议。然而,由于我们使用的T细胞数量有限,我们无法努力设置一个实验系统,在该系统中T帮助和BCR激动剂相互滴定,以优化共培养试验。我们计划在未来探索Tsh在涉及BCR参与的抗原依赖环境中的辅助功能。

2.2.6)更明确的疾病定义会有所帮助。“慢性炎症、高蛋白尿”并没有那么特异性,小鼠的年龄也没有。同样,是否对自身抗体和肾脏组织学进行了评估?

图2A和正文描述了与年龄、蛋白尿和自身抗体有关的疾病定义。自身抗体随年龄和疾病评分增加而增加。肾脏组织学未作评估。

https://doi.org/10.7554/188bet体育电竞eLife.53226.sa2

文章和作者信息

作者详细信息

  1. 斯蒂芬妮Gryzik

    德国风湿病研究中心(DRFZ),莱布尼茨研究所,柏林,德国
    贡献
    概念化,数据管理,形式分析,验证,调查,可视化,方法论,写作-原始草稿
    了同样的
    日元黄平君
    为对应
    s_gryzik@web.de
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
  2. 日元黄平君

    1. 德国风湿病研究中心(DRFZ),莱布尼茨研究所,柏林,德国
    2. 波茨坦大学,波茨坦,德国
    贡献
    概念化,数据管理,软件,形式分析,验证,调查,可视化,方法论,写作-原始草稿
    了同样的
    斯蒂芬妮Gryzik
    为对应
    yen.hoang@drfz.de
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
    兽人图标 "此ORCID iD标识本文作者:"0000-0001-8956-1709
  3. Timo Lischke

    德国风湿病研究中心(DRFZ),莱布尼茨研究所,柏林,德国
    贡献
    概念化、调查方法
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
    兽人图标 "此ORCID iD标识本文作者:"0000-0003-0413-4252
  4. Elodie莫尔

    德国风湿病研究中心(DRFZ),莱布尼茨研究所,柏林,德国
    贡献
    形式分析,调查,方法,写作-审查和编辑
    为对应
    埃洛迪。mohr@drfz.de
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
    兽人图标 "此ORCID iD标识本文作者:"0000-0003-3406-7302
  5. 梅勒妮文兹克

    德国风湿病研究中心(DRFZ),莱布尼茨研究所,柏林,德国
    贡献
    资源
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
  6. 伊莎贝尔Kadner

    1. 德国风湿病研究中心(DRFZ),莱布尼茨研究所,柏林,德国
    2. 波茨坦大学,波茨坦,德国
    贡献
    软件
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
  7. 约瑟芬Poetzsch

    1. 德国风湿病研究中心(DRFZ),莱布尼茨研究所,柏林,德国
    2. 波茨坦大学,波茨坦,德国
    贡献
    调查
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
    兽人图标 "此ORCID iD标识本文作者:"0000-0003-4238-3866
  8. Detlef Groth

    波茨坦大学,波茨坦,德国
    贡献
    方法
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
  9. Andreas Radbruch

    1. 德国风湿病研究中心(DRFZ),莱布尼茨研究所,柏林,德国
    2. Charité, Campus Mitte,德国柏林
    贡献
    资金收购
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
  10. Andreas Hutloff

    德国风湿病研究中心(DRFZ),莱布尼茨研究所,柏林,德国
    贡献
    监督,方法,写作-审查和编辑
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
    兽人图标 "此ORCID iD标识本文作者:"0000-0002-0572-8151
  11. 鲍姆格拉斯酒店

    1. 德国风湿病研究中心(DRFZ),莱布尼茨研究所,柏林,德国
    2. 波茨坦大学,波茨坦,德国
    贡献
    概念化,资源,监督,资金获取,调查,写作-原始草案,项目管理
    为对应
    baumgrass@drfz.de
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
    兽人图标 "此ORCID iD标识本文作者:"0000-0002-3289-1608

资金

德国联邦储备银行(0316164A)

  • 鲍姆格拉斯酒店

资助方没有参与研究设计、数据收集和解释,也没有决定是否将研究提交出版。

确认

我们感谢实验室的所有成员,以及Tobias Alexander、Gabriele Riemekasten和Jens Humrich提出的有帮助的意见和讨论。我们感谢Falk Hiepe和Manuela Frese-Schaper提供NZBxW小鼠。我们感谢Jenny Kirsch和Toralf Kaiser运营流式细胞仪核心设施(FCCF),也感谢动物设施的工作人员和实验室经理。

道德

动物实验:动物实验由柏林当地伦理委员会LaGeSo (Landesamt für Gesundheit und Soziales)批准,动物实验许可证为T0187-01和G0070/13。

高级编辑

  1. Satyajit Rath,印度科学教育和研究所(IISER),印度

检查编辑器

  1. Bernard Malissen,马赛卢米尼免疫中心,马赛Université,法国

评论家

  1. 乔·克拉夫特,耶鲁大学医学院,美国

出版的历史

  1. 收稿日期:2019年10月31日
  2. 接受:5月20日,2020年5月
  3. 已接受的稿件已发布:2020年5月22日(版本1)
  4. 出版版本:2020年6月5日(版本2)

版权

©2020,Gryzik等。

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