1. 结构生物学与分子生物物理学
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草酰乙酸脱羧酶钠泵钠转运的结构研究

  1. 鑫徐
  2. huigang shi.
  3. 晓文龚
  4. 普辰
  5. 应高
  6. 新郑张 是通讯作者
  7. 宋祥 是通讯作者
  1. 中国天津医科大学免疫微环境与疾病重点实验室生物化学与分子生物学系,中国天津医科大学
  2. 中国科学院生物物理研究所中国科学院生物大分子研究中心生物大分子国家实验室
  3. 中国科学院大学,中国
  4. 中国科学院上海生物科学研究院营养代谢与食品安全重点实验室,上海营养与健康研究所,中国科学院
研究文章
引用本文为:188bet体育电竞eLife 2020; 9: e53853 doi:10.7554 188bet体育电竞/ eLife.53853

摘要

脱氧酸脱羧酶钠泵(OAD)是一种独特的初级活性转运蛋白,其利用从细胞膜穿过钠输送的草酰乙酸酯脱羧的自由能。它由3亚基组成:α亚基催化羧基转移到从草酸乙酸盐到生物素,膜集成β亚基催化随后的羧基 - 生物素脱羧和偶联钠转运,γ亚基与α和β亚基相互作用并稳定OAD复杂。我们在这里展示了这个结构鼠伤寒沙门氏菌外形尺寸βγsub-complex。结构表明β和γ亚基形成a β3.γ3.杂六聚体与亚基之间广泛的相互作用,阐明了OAD全酶组装。结构导向的功能研究为β亚基的钠结合位点以及羧基生物素脱羧和通过OAD β亚基钠转运之间的耦合提供了深入的了解。

介绍

穿过细胞膜的钠梯度在许多微生物中被用作能量源,以驱动ATP合成、营养摄入、细胞运动和其他过程(Mulkidjanian等人,2008年).草酰乙酸酯脱羧酶钠泵(OAD)是第一鉴定的钠泵,其负责将微生物中的钠梯度保持在微生物中(Dimroth 1980).它是在许多细菌和古痤疮中发现,包括人类病原体Klebsiella Areogenes.Dimroth 1980),克雷伯氏菌肺炎Schwarz等人,1988年),鼠伤寒沙门氏菌威力和米暗,1989年),Legionella pneumophila.Jain等人,1996年).在厌氧柠檬酸发酵途径中起关键作用(迪姆罗斯等,2001),并已证明对某些病原体的致病性很重要(黄等人,1992年Jain等人,1996年).OAD利用草酰乙酸脱羧产生的自由能驱动钠在细胞膜上的转运。它由α、β和γ亚基组成。生物素在其反应中充当羧基的载体,并与生物素羧基载体蛋白(BCCP)共价连接α亚基C末端的结构域。α亚基中的羧基转移酶(CT)结构域催化羧基从草酰乙酸转移到生物素;β亚基催化随后的羧基-生物素脱羧和耦合钠转运;γ亚基通过与α和β亚基相互作用稳定OAD复合物(巴克尔,2001年迪姆罗斯等,2001).

OAD属于脱羧酶钠泵家族(巴克尔,2001年迪姆罗斯等,2001).该家族成员还包括甲基丙二酰辅酶a脱羧酶(MCD)、谷丙酰辅酶a脱羧酶(GCD)和丙二酸脱羧酶(MAD)。它们利用相关底物脱羧产生的自由能驱动钠通过细胞膜的运输,并构成一个独特的一级活性转运蛋白家族(赛尔等人,2016年).MCD和GCD催化两步脱羧/钠转运反应,类似于OAD反应(巴克尔,2001年).它们的CT和BCCP结构域分别由分离的α和γ亚基编码。它们的β亚基与OAD β亚基高度同源(图1 -图补充1a).它们还形成稳定的复合物并含有与OADγ亚基同源的脚手架δ亚基(图1 -图补充1b巴克尔,2001年).MAD催化更复杂的反应。这个Malonomonas rubraMAD将丙二酸中的羧基转移到特定的酰基载体蛋白上,然后再转移到生物素上。其MadB组分催化随后的羧基生物素脱羧和钠转运(Dimroth和Hilbi, 1997年).MadB与OAD β亚基同源(图1 -图补充1a).

OAD CT域的结构研究(Studer等人,2007年)及GCD (Wendt等人,2003年)对它们的底物脱羧作用提供了深入的了解。脱羧酶钠泵的CT和BCCP结构域的同源物可以在许多生物素依赖的酶中发现。对这些酶的结构研究也揭示了它们的功能(Jitrapakdee和Wallace, 2003年通,2013Waldrop et al., 2012).相反,关于脱羧酶钠泵中其他组分的结构知之甚少,并且其钠转运的机理理解得很差。我们在这里展示了这个结构鼠伤寒沙门氏菌外形尺寸(OAD)βγ亚复合物。结构表明β和γ亚基形成a β3.γ3.杂六聚体与亚基之间广泛的相互作用,并提供了深入了解OAD全酶组装。结构和结构导向的功能研究提供了深入了解钠结合位点在β亚基,并确定了一些关键的残基的功能。我们的数据表明,通过OAD β亚基钠转运的“电梯机制”,并为其与羧基生物素脱羧作用的耦合提供了见解。

后果

整体结构外形尺寸βγsub-complex

我们最初试图研究OAD全酶,并在大肠杆菌中表达大肠杆菌大肠杆菌)并通过6x组氨酸标签工程到γ亚基的n端和镍氮三乙酸(Ni-NTA)。该配合物经蒸汽扩散结晶后,在上海同步辐射装置上衍射至最高分辨率4.4 Å。十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析表明,它们不含α亚基,表明α亚基在结晶过程中游离,βγ亚络合物更稳定。我们进一步纯化了βγ亚复合物,从凝胶过滤实验来看,该复合物似乎折叠良好(图1 -图补充).虽然它结晶了,但晶体的衍射效果并不好。动态光散射实验表明,它的分子量为250 kDa,适合低温电子显微镜(EM)研究。我们进行了低温电子显微镜实验,确定了其结构(图1 -图补充3a-d)总分辨率为3.88Å(图1-figure补充3e).核心区域分辨率3.6 Å (图1-figure补充3f).优良的密度(图1 -图补充4a-e)允许我们将残留物13-432中的所有非氢原子放入β亚基中。α螺旋长度约为40个氨基酸的α螺旋(图1 -图补充4f).由于β亚基中的大多数残基已被解释,基于二级结构预测和密度特征,γ亚基中的2-43残基被分配到这个螺旋。该结构与实验数据和预期几何值(表1).蛋白质缓冲液中包含100mm的氯化钠,观察到钠离子的明显密度,可能是由于沉淀的中等。使用Cryo-EM结构作为搜索模型,我们通过分子替换确定βγ亚复合物的晶体结构(补充文件1A).低温电镜与晶体结构无明显构象差异。在手稿的其余部分,我们将主要讨论低温电子显微镜的结构,因为它的分辨率更高。

表1
低温电磁数据收集和结构细化统计
低温电镜结构OAD βγ亚配合物
数据收集和游行
放大倍数(名义) 105000年
电压(kV) 300
电子曝光(e-/一种2 50(32帧)
散焦范围(μm) 1.0 - -3.5
像素尺寸(Å) 0.68
对称强加 C3
初始粒子图像(不。) 260982年
最终粒子图像(编号) 75,699
地图解析(一) 3.88
FSC阈值 0.143
细化
初始模型使用 EMBUILDER生成的模型
模型分辨率(Å) 3.88
FSC阈值 0.143
地图锐化B因子(Å2 −250
模型组成
Non-hydrogen原子 10,227
蛋白质残留 1386.
配体 3.
B-因子(Å2
蛋白质 41.7
配体 23.9
.偏差
债券长度(Å) 0.008
键角(°) 1.016
验证
Molprobity得分 1.61
克拉什分数 5.83
可怜的旋转异构体(%) 0
拉马钱德兰情节
青睐 95.78
允许(%) 4.22
不允许(%) 0

结构表明β和γ亚基形成a β3.γ3.hetero-hexamer (图1A-B).通过动态光散射估计的预期分子量大于六聚体(168kDa)的分子量,可能由于与六聚体结合的洗涤剂分子。β亚基在六聚体的中心形成三聚体,γ亚基位于周边。β亚基三组织的一侧主要充电,相反的一侧是带负电(图1c-d).“积极的内部规则”(冯·海伊恩,1992年)表明带正电的一面位于细胞质中。这一边也集中了保守残基(图1 -图补充5a-d).该结构揭示了连接细胞质和周质的溶剂可接近通道。

整体结构外形尺寸βγsub-complex。

一个)-(b)结构OADβ3.γ3.hetero-hexamer。γ亚基以蓝色表示,并用卡通表示。第一和第二β亚基(β1和β2)的支架结构域为青色,核心结构域为绿色,E结构域为橙色,螺旋发夹结构域为品红。除非另有说明,否则整个手稿都使用了这种配色方案。第三β亚基(β3)呈灰色。对β1和β2、β3的分子表面进行了动画表征。在我们的结构中可以看到γ亚基中的第一个残基和最后一个残基(分别是残基2和残基43)。结构图由PyMOL (www.pymol.org.).(c)-(d)溶剂评估表面的静电电位OAD β亚基三聚体。小组委员会的意见(c) 和 (d)与面板的视图相同(一个) 和 (b),分别。γ亚基用卡通表示,并用蓝色表示。嵌板上的红色和黑色圆圈(b) 和 (d)分别表示β亚基细胞质面第1和第2个负电荷区。嵌板内的黑线(一个) 和 (c)表示膜双层的界限。

该结构表明,γ亚基C端尾位于细胞质中,可介导与α亚基的相互作用(图1A-B).这与之前的报道一致,即分离的γ亚基c端尾部与α亚基相互作用(Balsera等人,2011年Dahinden等人,2005年), α亚基不能与γ亚基变异在该区域发生突变或缺失(Schmid等人,2002年).要直接测试γ亚基C末端尾部介导α亚基与βγ亚复合物之间的相互作用,我们产生了Δγct变体OAD表达构建体缺乏γ亚基残留物61-84。除去的残留物跨越预测的两亲螺旋(图1 -图补充1b)霍乱弧菌OAD同种型2(vc.OAD2)的α亚基结合结构域(AD)形成类似丙酮酸羧化酶(PC)四聚化结构域(PT)的结构域(Balsera等人,2011年).我们发现ΔγCT截断并不影响可溶性组分中α亚基的蛋白质水平(图1 -图补充6a)或β和γ亚基之间的相互作用(图1 -图补充6b).然而,它严重减少了与βγ亚复合物共纯化的α亚基的数量(图1 -图补充6b).这些数据表明γ亚基C末端尾部不涉及β和γ亚基之间的相互作用,而是在α亚基与βγ络合物之间的相互作用中起着关键作用。

的结构外形尺寸β亚基

β亚基由10个跨膜螺旋(T1-10)、两个螺旋发夹(H1a/b和H2a/b)和一些额外的螺旋(图1一个图2 a - c).其N-和C末端半部形成两种反转拓扑(图2C.).T2和T3'之间的区域包含四个螺旋(αE1-4),形成溶剂暴露的结构域E。该结构域保守性差,在某些生物体的OAD中不存在(图1 -图补充1a).H1和H2从相对两侧指向β亚基的内部。它们与周围的T4-5和T9-10螺旋形成束状核域。H1和H2的尖端在核心区域的中间相遇。β亚基的其余部分形成一个支架结构域,在一边围绕着核心结构域(图2 a - b).

β亚单位的结构。

一个)-(b)结构外形尺寸β亚基。在面板(b),一个视图沿面板箭头指示(一个).(cβ亚基的拓扑结构。浅蓝色和浅绿色的框表示β亚基的反向重复。

检索已发表的结构(霍尔姆和Rosenström, 2010),表明β亚基最接近的结构同源物是钠/柠檬酸的共体CitS (Kim等人,2017年Wöhlert等人。,2015年).委员会的结构沙门氏菌血清cits(SeCitS)和β亚单位可以叠加为等效Cα原子的均方根偏差4.1Å(图2 -图补充1a-b),尽管它们的序列同一性有限(8%,图2 -图补充1c).β亚基核心和支架结构域的所有主要二级结构元素在CitS中都有等价物,在其n端包含一个额外的螺旋。β亚基属于阳离子:质子反转运蛋白(CPA)超家族,并被认为与CPA2家族的蛋白质具有同源性(http://www.tcdb.org/search/result.php?tc= 3.责任)。我们一致发现OAD β亚基结构与钠/质子反向转运蛋白NapA (图2-图补编2a-b巧合等人,2016年李等人,2013年),是CPA2家族的一员。它也与钠/质子反转运体NhaP (Paulino等人,2014年Wöhlert等人。,2014年)和nhaa(亨特等人,2005年李等人,2014年),钠/胆汁酸Symporters ASBT(胡等人,2011周等,2014)等。核域的同源性是明显的。在这些β亚基同源物中,在H1和H2的位置包含两个不连续的跨膜螺旋(图2 -图补充2a).支架结构域也与NapA和NhaP的等效区域具有显著的同源性,其中包含一个额外的螺旋(图2 -图补充2b).

亚基之间的互动

在我们的结构中观察到β亚单位之间广泛的相互作用。这种相互作用主要由支架结构域介导(图3a-b).在三聚接口的外部,T1和T2在相邻单体中与T6和T7相互作用。朝向中心,相互作用由T3',T3和T8介导。这些相互作用主要由疏水性残留侧链介导。2700Å.2的表面积埋在不同单体中支架结构域之间的每个界面上。E域的螺旋αE4对三聚体界面也有较小的贡献。250年,一个2不同单体的αE4之间的界面处埋有不同的表面积。

互动外形尺寸β亚基。

一个)-(b)结构外形尺寸βγsub-complex。三个β亚基的脚手架域在青色,橙色和蓝色突出显示。它们的二级结构元素标记为。β亚基核心结构域和γ亚基是灰色的。(c)结构SeCitS二聚体(PDB 5A1S)。中向内开放构象的单体1与β1排列面板中的OADβγ子复合体(一个).单体2为向外开放构象。构成单体1和2中“楔形”的结构元素分别以红色和黄色标记和突出显示。支架结构域中的其他元素分别以青色和蓝色显示(d)示意图β亚基三聚体和SeCits Dimer。单体彩色如图1一个

与β亚基不同,同源CITS形成二聚体(Kim等人,2017年Wöhlert等人。,2015年).结构分析表明,CitS中T1和T6及其等价物的构象差异较大(图2 -图补充1b)在确定低聚状态方面发挥关键作用。在β亚基中,T1和T6位于芯结构域附近。在Cits中,等效H2和H8远离核心域(图3-figure补充1a).H2和H1 n端与CitS二聚体中另一个单体的H8相互作用(图3C.图3-figure补充1a).与等效区域相比OAD β亚基,这些螺旋在单体之间的界面上形成一个“楔形”,促进二聚体的形成(图3 c - d).β亚基的其他同源物,包括NapA (巧合等人,2016年李等人,2013年)和NhaP(Paulino等人,2014年Wöhlert等人。,2014年)也形成二聚体,在二聚体界面上观察到相似的结构(图3 -图补充1b-c).T1和T6的构象分别与相邻T2和T7的广泛且大多数疏水相互作用稳定(图2B.).在CitS, NapA和NhaP中,一些邻近的结构元素有助于T1/T6当量的完全不同的构象的稳定(图3 -图补充1a-e).

我们的结构还揭示了β和γ亚基之间广泛的相互作用。每个γ亚基与一个β亚基相互作用(图3-Figure补充1F).界面埋设3100Å2主要由疏水侧链残基组成。β亚基中的T6对界面有重要贡献。然而,如果它像在CitS中一样位于远离核域的位置,它就不会与γ亚基相互作用。额外的相互作用是由T4和T10介导的。

结构分析表明,T1和T6的位置是β亚基三聚化和γ亚基结合的关键。为了探究T1和T6位置的功能作用,我们在β亚基中引入了取代,以促进它们采用类似于CitS的构象。将T1、T6及相邻区域替换为in中的等效区域Secits。与我们的假设一致,我们发现取代的β/ Cits蛋白不再与γ亚基相互作用(图3-figure补充1g),并且可能是二聚体(图3-figure补充1h).

β亚基的钠结合位点

在牙上发现了几个蛀牙外形尺寸βγsub-complex。在β亚基三组织的中心发现到周质的大腔开口。其中的密度被建模为在复合纯化中使用的三种N-十二烷基-D-麦芽糖苷(DDM)分子(图4A).该腔主要由T3',T3和T8中具有疏水侧链的残基形成,表明它可能不会有助于钠结合。此外,每个β亚基在细胞质面上含有两个带负电荷的空腔。第一腔在芯和支架结构域之间形成,大约8埃,在开口处达到8埃。与它相邻的第二个较浅(图1 d)第一个空腔在脱羧酶钠泵中高度保守,而第二个空腔中的残留物变化更大(图1-Figure补充5C-D).这表明第一腔可以是用于带正电荷的钠离子的结合位点,其应存在于所有脱羧酶钠泵中。

假定的钠结合位点外形尺寸β亚基。

一个)溶剂可接近表面的剖视图OADβ3.sub-complex。表面根据静电势着色。螺旋发夹H1, H2和Asp203和Ser382侧链在他们的尖端突出。γ亚基用卡通表示,并用蓝色表示。复合物中心腔内的DDM分子以棒状表示,其碳原子为灰色。(b)β亚单位中假定钠结合位点的结构。灰色球体1和2分别表示CIT中第一个和第二个钠结合位点的等效位置。附近的极性组或带电组将高亮显示。(c)ITC实验探测与野生型的钠结合OADβγ亚复合物和在假定的β亚单位钠结合位点处发生替换的变体。将数据拟合到一组位点结合模型中会产生误差(d野生型草酰乙酸脱羧作用在假定的β亚基钠结合位点上具有替换的OAD和变异。活性通过补充α亚基和洗涤剂溶解的βγ亚复合物来重建。比活度定义为反应速度除以反应量旁边。在对照实验(CTRL)中,在反应混合物中省略βγ亚络合物。误差条表示三个独立实验的标准偏差。C1/2,半最大活性的钠浓度;V马克斯,最大比活度。C的值1/2和V马克斯他们的误差来自于数据拟合。

钠结合位点的额外提示来自β亚基同源物的结构研究。在Cits的结构中观察到钠或钠咪钠离子(Kim等人,2017年Wöhlert等人。,2015年), NhaP (Wöhlert等人。,2014年)及ASBT (胡等人,2011).钠结合位点位于Cits的螺旋发夹的尖端和NHAP和ASBT的等效位置之间。在β亚基中,高度保守的H1和H2提示在推定的钠粘合腔的底部相遇(图4A).H1和H 2尖端各自含有具有极性或带电侧链,ASP203和SER382的一个残留物。他们的侧链指向螺旋发夹尖端之间的空间(图4B.).这样的结构表明Asp203和Ser382侧链可能参与了钠结合。

为了探讨Asp203和Ser382在钠结合中的作用,我们引入了D203A和S382A替换。凝胶过滤实验表明,取代均不影响其整体结构βγ亚复合体(图1 -图补充).接下来,我们通过等温滴定量热法(ITC)确定了它们对钠结合的影响。ITC实验揭示了aKd为3.7 mM,钠与野生型结合外形尺寸βγsub-complex。值得注意的是,D203A和S382A取代完全消除了钠结合(图4C.图4 -图补充图4-源数据1),表明Asp203和Ser382侧链对钠结合起关键作用。与之前的报道一致,OAD连续的草酰乙酸脱羧需要钠(Dimroth 1982Dimroth和Thomer,1988年)和一个功能性β亚基(迪·贝拉迪诺和迪姆罗斯,1996年Jockel等,2000aJockel等,2000b),我们的活性测定表明,这些取代也严重抑制了脱氧酸酯脱羧剂旁边。虽然洗涤剂溶解的野生型OAD βγ亚络合物强烈刺激草酰乙酸脱羧,由α亚基在钠存在下的活性取代OAD βγ亚配合物丢失(图4D图4-源数据2).

SeCitS,第二个钠离子被束缚在其螺旋发夹的顶端附近。螺旋发夹2中的极性基团和邻近的Ser427侧链(Wöhlert等人。,2015年).残基相当于Ser427在OAD β亚基是高度保守的Asn412 (图4B.).为了探究Asn412侧链在钠结合中的功能,我们引入了N412A取代,这并不影响Asn412侧链的整体结构βγ亚复合体(图1 -图补充).我们发现,这种替代导致ITC实验中产生的热量减少了60%以上,并增加了3.5倍Kd图4C.图4 -图补充图4-源数据1),表明钠结合热力学发生了显著变化。它还严重抑制草酰乙酸脱羧外形尺寸(图4D图4-源数据2).在一起,这些数据表明ASN412侧链在钠结合中的重要作用。

OAD在每个反应循环中运输两个钠离子(Dimroth和Thomer,1993年),其β亚基可能包含两个钠结合位点(Jockel等,2000b).Asp203、Ser382和Asn412侧链的空间位置(图4B.)表明ASP203和SER382有助于第一钠结合位点,ASN412有助于第二个。在SeCitS,钠离子只有在第一个位点被占据时才能与第二个位点结合(Wöhlert等人。,2015年).我们的数据显示,D203A和S382A取代严重抑制了钠离子的结合,而N412A取代的作用较温和,表明OAD β亚基中的两个钠离子结合位点也依次被占据,这与报道的两个钠离子与OAD的协同结合(Jockel等,2000b).

在我们的结构中,假定的钠结合位点可以从细胞质中获得,但不能从细胞质周围获得(图4A).这表明该结构在向内开放构象中捕获了β亚基。

β亚基必需残基的诱变筛选

在许多依赖生物素的酶中,极性或带电荷的氨基酸侧链在其羧基转移反应中发挥关键作用,生物素作为羧基载体(通,2013Waldrop et al., 2012).为了了解羧基生物素由β亚基脱羧,我们调查了细胞质表面有这样的侧链的β亚基残基,羧基生物素脱羧很可能发生在那里。我们关注的是高度保守的残基,因为在功能上重要的残基通常是保守的。共发现17个此类残留物(图5A图1 -图补充5d)其中,Thr148、Asp149、Tyr227、Thr318、Arg389、Asn392和Ser419的等同物已在本发明中表征克雷伯氏菌肺炎外形尺寸(Kp外形尺寸)(迪·贝拉迪诺和迪姆罗斯,1996年Jockel等,2000aJockel等,2000b).研究发现,它们的取代并没有严重抑制草酰乙酸脱羧(补充文件1B.).此外,Arg250、Glu298和Asn315的侧链极少暴露于溶剂(图5A),在羧基生物素脱羧作用中可能不起重要作用。在排除了这些残基以及我们在上一节中描述的Asp203、Ser382和Asn412之后,我们探讨了Glu40、Arg258、Arg304和Asn311的突变功能。

β亚基功能必需残基的突变筛选。

一个)β亚基细胞质面的结构。突出了具有极性或带电侧链的高度保守的残留物。通过我们的研究和之前的研究表征了红色和带下划线标签的残留物Kp外形尺寸,分别。'和″符号分别表示复合物中第二个(黄色)和第三个(灰色)β亚基中的残基。黑色的周期表示假定的钠结合腔。(b草酰乙酸脱羧β亚基细胞质面替换的OAD。这里显示了野生类型复合体的数据以进行比较。(c)ITC实验探测钠与蛋白质的结合OAD βγ亚复合物与β亚基细胞质面取代。这里显示了野生类型复合体的数据以进行比较。

我们将GLU40,ARG258,ARG304和ASN311介绍给丙氨酸取代。没有发现任何替换会影响整体结构βγ亚复合体(图1 -图补充).接下来我们研究了它们对草酰乙酸脱羧的影响(图5B.图5源数据)及钠结合(图5C.图5 -图补充图5 - 源数据2).E40A取代对草酰乙酸脱羧有明显抑制作用。这种取代也适度降低了对钠的亲和力,并导致了2.6倍的增加Kd.R258A取代对草酰乙酸脱羧作用和钠结合作用影响不大。R304A和N311A取代适度抑制草酰乙酸脱羧。两种替代都使钠浓度增加了3倍,以达到半最大活性(C1/2);N311A的取代也使最大活性降低了40%以上。两者对钠的结合都没有明显影响。在一起,这些数据表明,Glu40侧链对β亚基的carboxyl-biotin去至关重要但不作出重大贡献的绑定,钠Arg304 Asn311侧链也很重要,Arg258侧链不太可能发挥重要作用。

pH对钠结合的影响外形尺寸βγsub-complex

在OAD催化过程中,β亚基从质周获得一个质子并将其提供给羧基生物素脱羧(迪·贝拉迪诺和迪姆罗斯,1996年Dimroth和Thomer,1983年).为了测试质子和钠结合β亚基是否相互影响,我们在pH从5.55到8.45的范围内重复我们的ITC实验,对应的质子浓度变化近1000倍。我们发现钠结合受pH (图6 - 数字补充1A-B图6源数据).pH值从8.45降低到5.55,可增加pH值Kd两倍以上(补充文件1C).的Kd值基本上不受缓冲区的不同选择的影响(补充文件1C),表明观察到的效果主要是由于质子浓度的差异。的Kd值随质子浓度的增加而线性增加(图6图6源数据),与质子和钠的竞争性结合一致(Leone等人,2015年).我们的结构和结合数据表明,钠离子结合到胞质面内向内开放的β亚基(图4 a - c).我们分别在pH 7.5和5.5下进行的低温电子显微镜和晶体学研究,捕获了向内开放构象中的β亚基,表明在我们的实验条件下,在较大的pH范围内,它是首选构象。总之,这些数据表明质子和钠竞争结合到同一个腔内开放的β亚基。在没有竞争对手的情况下,绑定的绝对分离常数可以通过拟合数据到竞争绑定模型(Hariharan和Guan,2017Leone等人,2015年).我们的数据表明,钠(KD (Na +))和质子(KD(H +))分别为0.81±0.03 mM和1.9±0.2 μM (图6).pK一个对于从对数计算的β亚基质子结合组KD(H +)是5.73。在E40A取代剂中也观察到类似的效果βγ亚复合体(图6图6 -图补充1c图6源数据补充文件1C).

深入了解OAD反应循环。

一个)钠结合到OADβγ亚复合物受到pH的影响。解离常数(Kd (Na +)从不同pH的ITC实验中衍生出来的衍生,绘制质子浓度。误差栏代表从拟合ITC数据到一组站点模型的错误。实线表示具有竞争性绑定模型的数据配合。线的Y和X轴截距表示钠和质子的绝对解离常数的值(KD (Na +)KD(H +)),分别。(b) oad催化的钠转运模型。β亚基中的成分呈颜色,如图1.为简单起见,只显示了一个β亚基,省略了它的E域。灰色条表示膜双分子层。字母“D”表示羧基生物素脱羧的直接质子供体。

在以前的许多研究中,为了表征膜蛋白结合的钠/质子竞争,在相同pH下进行的ITC实验揭示了钠结合焓和缓冲质子化焓之间的强相关性(Hariharan和Guan,2017Leone等人,2015年).在这些研究中,钠通过竞争从蛋白质中释放质子。随后与缓冲分子结合的质子有助于观察到的相关性。我们还测试了一些不同质子化焓的缓冲液(补充文件1CGoldberg等人,2002年),但没有观察这样的相关性(图6 -图2a-b图6源数据).估计的P.K一个对于β亚基质子结合基团表明它在pH 5.79处接近50%,在该pH 5.79处,在该pH中进行了一组ITC实验。缺乏相关表明,大部分释放的质子不会与缓冲分子结合。密切检查OADβ亚基结构揭示了在周质面上的四种溶剂暴露的组氨酸残基(图6 -图2c附录).在我们的ITC实验中,这些组氨酸残基可以为释放的质子提供结合位点。

讨论

我们提出的假定的钠结合位点得到了先前的突变研究的支持Kp与它们在钠配位中的作用一致,发现Asp203和Ser382等同物上的取代在KpOAD (Asp203和Ser382)严重破坏了其功能(迪·贝拉迪诺和迪姆罗斯,1996年Jockel等,2000b).此外,我们的结构表明,Ser419侧链与H1端Gly201主链羰基形成氢键(图4B.),提示Ser419在稳定第一个钠结合位点中起作用。与此作用相一致的是,我们发现将Ser419等价替换为Kp带有丙氨酸的OAD (Ser419)将其草酰乙酸脱羧活性降低了90% (Jockel等,2000a).

我们的突变筛选鉴定了β亚基功能的一些关键残基,包括Glu40, Asp203, Arg304, Asn311, Ser382和Asn412 (图5A).我们的数据表明,Asp203, Ser382和Asn412侧链配合了OAD催化所需的钠离子。他们和Glu40, Arg304和Asn311的侧链,可能有额外的功能。例如,它们中的一些可能参与协调生物素部分,和/或传递羧基生物素脱羧所需的质子。这些残留物都位于假定的钠结合腔内(图5A)我们的ITC实验表明钠和质子竞争结合到这个空腔(图6).这些数据在一起,与羧基 - 生物素脱羧在钠结合腔中发生的模型一致。与腔腔的钠可以促进质子的释放用于羧基 - 生物素脱羧,为OAD的连续草酰乙酸叔羰基化的钠要求提供了解释(Dimroth 1982).然而,与钠竞争结合的质子与羧基生物素脱羧的质子是相同的,这一反应发生在其他地方的可能性仍有待确定。为了准确定位羧基生物素脱羧的位置,并了解重要残基的功能作用,我们确定了羧基生物素与β亚基相互作用的清晰图像。

一些钠转运体的结构研究,包括CitS (Kim等人,2017年Wöhlert等人。,2015年),纳帕(巧合等人,2016年李等人,2013年)和NhaP(Paulino等人,2014年Wöhlert等人。,2014年).这些研究揭示了底物结合域对支架域的“电梯状”运动将底物穿过膜(德鲁和布德克,2016年).它们的基材结合和支架结构域与芯和支架结构域同源分别为OAD β亚基。在OAD β亚基,核心和支架结构域之间的界面主要由疏水残基组成,这可以促进类似的电梯状运动。此外,我们的数据表明,钠离子可能结合到相同的位置OAD β亚基,CitS和NhaP。这些数据表明,OAD β亚基也可能利用类似的“提升机制”进行钠转运(图6 b).钠和质子在结合向内开放的β亚基方面的竞争(图6)与“升降机”运动也向相反方向运输羧基生物素脱羧的质子的模型一致(图6 b).我们的模型与报道的脱羧酶钠泵的可逆性一致(Dimroth和Hilpert, 1984年),并且可以在没有丙酮酸和草氟乙酸盐的情况下通过OAD提供观察到的内部/外部钠交换机制(Dimroth和Thomer,1993年).在这种情况下,酶不能催化功能循环,无论是向前或向后;然而,β亚基可以在钠结合的向外和向内开放构象之间相互转换,从而催化钠通过膜的被动交换。

我们的ITC实验和提出的OAD反应周期表明,在反应过程中,OAD各组分之间存在精确的协调。在大多数生理条件下,钠浓度超过质子浓度一百万到十亿倍。通过ITC实验确定的质子和钠的绝对解离常数相差不到500倍。因此,在大多数生理条件下,内向开放的β亚基容易由于竞争性的钠结合而失去结合的质子。如果它是相同的质子羧基生物素脱羧,我们的模型表明,向内质子运输β亚基(状态5到1描述图6 b)伴随着同步的羧基生物素转移到β亚单位,或者质子通过竞争性钠结合丢失到溶液中。

根据蛋白质的保守性和预测的位置,在Kp已选择OAD β亚基进行突变研究(迪·贝拉迪诺和迪姆罗斯,1996年Jockel等,2000aJockel等,2000b).结合突变数据和我们的结构,我们可以深入了解它们的功能(图6 -图3a补充文件1B.).除了ASP203和SER382之外,还发现TYR229,ASN373和GLY377的替代品KpOAD β亚基也严重影响其功能(Jockel等,2000aJockel等,2000b).相同的残留物OAD β亚基是Tyr229, Asn373和Gly377。T5中的Tyr229侧链与T9附近的Leu343主链羰基形成氢键(图6 -图3b).Asn373侧链n端到H2与Glu249主链羰基c端到T5形成氢键(图6 -图3c).H2中的Gly377对T9包和它们之间的空间不能容纳氨基酸侧链(图6 -图补充3d).因此,Tyr229、Asn373和Gly377对于核域的正确折叠非常重要。这些残基上的取代可能通过扭曲其结构而破坏β亚基的功能。

β和γ亚基之间广泛的相互作用表明它们形成了相似的β3.γ3.异六聚体在OAD全酶中。在最近的研究中vc.OAD2,蓝色原生PAGE分析显示为多种;发现分子量为530 kDa和750 kDa的两个物种包含所有三个亚基(Balsera等人,2011年)这两个物种可能代表与不同数量的α亚基相关的βγ亚复合物,表明α亚基和βγ亚复合物的结合是动态的。我们的抗HA琼脂糖纯化的蓝色本机PAGE实验OAD Complex还揭示了类似分子量的物种(图3-figure补充1h),但它们是否含有α亚基仍有待观察。γ亚基c端尾部以1:2的摩尔比与α亚基结合(Balsera等人,2011年),建议β3.γ3.异六聚体最多能结合6个α亚基。α亚基由CT、AD和BCCP结构域组成。分离的α亚基是二聚体(Balsera等人,2011年),可能是通过其CT域的二聚体交互(Studer等人,2007年).在我们的结构中,三个γ亚基(Phe43)中最后可见的残基位于~ 65Å之间。一个简单的模型表明,三个α亚基二聚体可以同时与β中的三个γ亚基c端尾相互作用3.γ3.hetero-hexamer (图6 -图附录).模拟的α亚基通过CT域二聚。每个α亚基二聚体中的一个AD域与γ亚基c端尾部相互作用。该模型表明α亚基二聚体之间的相互作用可能也存在,并在稳定OAD复合物中发挥作用,这与最近的一项研究一致,即分离出的γ亚基c端尾促进α亚基四聚体的形成(Balsera等人,2011年)该研究表明,α亚单位四聚化是由不同α亚单位二聚体中的AD结构域介导的。在γ亚单位中,预测的可能与AD结构域相互作用的两亲螺旋(Balsera等人,2011年)通过20个残基的连接体连接到跨膜螺旋(图1 -图补充1b).这种连接器可以提供灵活性,并允许不同α亚基二聚体中的AD域相互作用(图6 -图附录).

OAD软酶可以提供平台,以促进其组分的潜在协调。例如,γ亚基与β亚基的核心和支架结构域相互作用(图1一个).在拟议的“电梯”运动中为钠运输,核心和支架结构域的相对取向急剧变化(图6 b).预期γ亚基的同步构象变化,其可以又耦合到α亚基的构象变化。α和β亚基的这种同步可以在协调其活动中起作用。

我们的研究为OAD的功能提供了重要的见解。然而,对其分子机制的全面了解还需要进一步的深入研究。我们提出的“提升机制”很大程度上是基于与CitS和其他转运体的结构同源性,这需要在反应循环的不同阶段通过β亚基的额外结构来验证和改进。需要对β亚基与生物素和其他底物复合物的结构进行研究,以阐明羧基生物素脱羧发生的位置及其如何驱动钠转运。重要的是,草酰乙酸脱羧如何与钠转运耦合尚不清楚。对OAD全酶的结构研究可以为这一过程提供有价值的见解。

材料和方法

关键资源表
试剂类型
(物种)或
资源
指定 源或引用 标识符 额外的
信息
基因(鼠伤寒沙门氏菌 OAD. 基因库 GenBank: CP007235.2,碱基836524-839869
应变,应变背景(大肠杆菌 BL21星(DE3) 热费希尔 C602003 化学主管细胞
抗体 anti-HA(兔单克隆) 细胞信号传导技术 猫# 3724年代 1:1000
抗体 酶联抗兔IgG(山羊多克隆) 细胞信号传导技术 猫# 7074 p2 1:2000
抗体 酶联抗6x组氨酸标签(山羊多克隆) Abcam 猫#ab1269 1:5000
DNA重组试剂 OAD-pET28a(质粒) 本文,材料与方法 OAD的表达,可以从翔实验室获得
DNA重组试剂 OAD-β/ CITS-PET28A(质粒) 本文,材料与方法 OAD β/CitS变异表达,可从翔实验室获得
DNA重组试剂 OADα-PET28A(质粒) 本文,材料与方法 OADα亚基屈服,可以从Xiang Lab获得
商业测定试剂盒 Novepage Novex BIS-TRIS凝胶 热费舍尔 猫# BN1001BOX
软件、算法 动态V6 Wyatt Technologies
软件、算法 MotionCor2 郑等,2017
软件、算法 CTFFIND4 罗州和格里戈里夫,2015年
软件、算法 e2boxer.py 唐等人,2007
软件、算法 RELION Scheres,2012年
软件、算法 伊曼 Ludterke等。,1999年
软件、算法 灌市 周等,2017
软件、算法 傻瓜 埃姆斯利和考坦,2004年
软件、算法 凤凰 亚当斯等人,2010年
软件、算法 ResMap Kucukelbir等人。,2014年
软件、算法 DALI服务器 霍尔姆和Rosenström, 2010
软件、算法 HKL2000. 奥特维诺夫斯基和小调,1997年
软件、算法 莫尔雷普 Vagin和Teplyakov, 1997年
软件、算法 起源7.0 originLab.
软件、算法 QTIPLOT www.qtiplot.com.

蛋白表达与纯化

请求详细的协议

OAD操纵子被扩张鼠伤寒沙门氏菌并插入载体pET28a (Novagene)。由此得到的重组蛋白在γ亚基的n端包含一个6x组氨酸标签。对于蛋白表达,该质粒和pTYB12(新英格兰Biolabs)基质粒含有大肠杆菌生物素连接酶Bira.基因将基因共转换成大肠杆菌菌株BL21星(DE3)。细胞在添加50 mg/升卡那霉素和100 mg/升氨苄西林的Luria-Bertani培养液中培养,用0.5 mM异丙基-β- d -硫代半乳糖苷(IPTG, Bio Basic)诱导16°C 16小时。诱导前补充d -生物素15 mg/l。收集的细胞在含有20 mM Tris pH 7.5、300 mM氯化钠、2 mM β-巯基乙醇(β-ME)和0.2 mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的缓冲液中裂解,使用AH-2010均质器(ATS Engineering)。用6000 g离心15分钟清除裂解液,再用200,000 g离心1小时收集膜组分。提取膜蛋白的方法是将膜组分与含有20 mM Tris pH 7.5、300 mM氯化钠、2 mM β-ME、0.2 mM PMSF和1% DDM的缓冲液在4°C下孵育12小时。悬浮液20万g离心30分钟后提取外形尺寸与Ni-NTA纯化琼脂糖(试剂盒)和大小排斥(Superose 6增加10/300 GL,通用电气医疗集团)列,集中在缓冲含有10毫克/毫升20毫米三pH值7.5,100毫米氯化钠,2毫米二硫苏糖醇(DTT)和0.02%的DDM, flash在液态氮冷却和储存在−80°C。凝胶位移分析表明,α亚基在纯化产物中OAD复合物完全生物素化。

净化OAD βγ亚配合物,氯化钠浓度在ni - nta中纯化OAD降低到100 mM,并将解决方案加载到Hitrap Q柱(GE Healthcare)。纯从flow-through中收集OAD βγ亚复合物,并通过Hitrap Heparin (GE Healthcare)和尺寸排除(Superose 6 increase 10/300 GL, GE Healthcare)柱进一步纯化。将纯化的配合物在含有20 mM Tris pH 7.5、100 mM氯化钠、2 mM DTT和0.02% DDM的缓冲液中浓缩至10 mg/ml,在液氮中快速冷却,并在−80°C保存。

净化来自表达OAD的细胞的OADα亚单位OAD复合物,细胞裂解液的可溶性部分与单体亲和素琼脂糖(Pierce)孵育。结合蛋白用添加2 mM d -生物素的裂解液洗脱。

净化检测OAD α亚基的活性,将相应基因片段插入载体pET28a中。质粒与大肠杆菌共转化Bira.-含有质粒的大肠杆菌菌株BL21星(DE3)。在添加15 mg/l d -生物素后,用0.5 mM IPTG在16℃诱导细胞16小时。完全生物素化6x组氨酸标记OADα亚单位用Ni-NTA和尺寸排除(Superdex 200增加10/300 GL)柱纯化,在含有100 mM磷酸钾(pH 6.5)和0.02%DDM的缓冲液中浓缩至10 mg/ml,在液氮中快速冷却并储存在室温下−80摄氏度。

构建该基因的表达质粒OAD β/CitS变异,基因片段为SeCits残留物1-79和238-319是密码子优化以表达大肠杆菌和合成(Genewiz)。这些片段被用来代替基因片段OADβ亚基残留物1-39和247-300分别构建OAD表达式。在β/CitS变体或野生型β亚基的编码区5 '端添加一个ha编码寡核苷酸。纯化ha标记OAD或β/CitS变体,表达相应复合物的细胞裂解液的膜部分与抗HA琼脂糖(Pierce)孵育,结合蛋白用含有20 mM Tris (pH 7.5)、100 mM氯化钠、0.02% DDM和2 mg/ml HA肽(Sangon Biotech)的缓冲液洗脱。

使用QuikChange试剂盒(安捷伦科技公司)生成氨基酸替换,并通过DNA测序进行验证。按照野生型复合物的相同方案表达和纯化取代的复合物。

蓝色的本地页面

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使用Precate NovePage Novex BIS-TRIS凝胶(4-16%,Thermo Fisher Scientific)在制造商的方向之后进行蓝色本机页面。将所有样品交换到含有50mM HEPES(pH7.4),20mM氯化钠和1%DDM的缓冲液中,然后在加载到凝胶之前。NativeMark未染色蛋白标准(Thermo Fisher Scientific)用作分子量标记。

抗体

使用抗HA兔MAB(3724s,细胞信号传导技术)和辣根过氧化物酶(HRP) - 抗兔IgG(7074P2,细胞信号传导技术)抗体检测HA标签。HRP连接的抗-6X组氨酸标签抗体(AB1269,ABCAM)用于检测6x组氨酸标签。

动态光散射

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动态光散射实验在DynaPro NanoStar仪器(Wyatt Technologies)上进行,温度为25°C。的在含有20 mM Tris pH7.5、100 mM氯化钠、2 mM DTT和0.02% DDM的缓冲液中,在36 μM的浓度下对OAD βγ亚配合物进行了表征。数据分析使用DYNAMICS V6软件(Wyatt Technologies)。

结构测定与分析

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为低温电镜研究准备网格,3 μl将OADβγ亚络合物施加到发光排出的400目孔碳栅格(QualifoilR1.2 / 1.3,Cu)上。在通过滤纸中擦除过量的样品以进行3.5秒(Leica EMGP),闪光闪烁成液体乙烷。在Titan Krios G2透射电子显微镜上收集了Cryo-EM数据,配备了直接检测器,带有GIF量子能量滤波器(K2峰会)。该网格在超级分辨率模式下成像,放大率为105,000,产生像素尺寸为0.68。插入20eV狭缝的能量过滤模式。总剂量为50电子/Å2从9.25 s开始,将曝光剂量分为32帧。收集的显微照片的离焦范围为1μm至3.5μm。通过MotionCor2校正光束引起的运动(郑等,2017).采用CTFFIND4 (罗州和格里戈里夫,2015年).56052个粒子被e2boxer.py (唐等人,2007)的子数据集。由RELION制作的特色2D职业平均水平(Scheres,2012年)二维分类作为RELION自动粒子选取的参考,在821张精选显微照片中(不含剂量加权)选取260,982个粒子。经过两轮无参比二维分类,筛选出6个好类129,525个粒子进行进一步数据处理。利用StartCSym在EMAN (Ludterke等。,1999年)施加C3对称性。在3D分类而不强加对称性的情况下,仅选择一个具有75,699个颗粒的良好阶级进行3D细化。从剂量加权显微照片中重新提取这些颗粒,并用施加的C3对称性精制。最终重建的分辨率是3.88埃,由黄金标准傅立叶壳相关(FSC)在截止0.143中确定,后处理后处理。初始结构用EMBUILDER (周等,2017).该结构由COOT完成(埃姆斯利和考坦,2004年),并使用PHENIX实现的真实空间细化(亚当斯等人,2010年).使用ResMap (Kucukelbir等人。,2014年).结构同源物与Dali服务器(霍尔姆和Rosenström, 2010).

纯化OAD配合物在蒸汽扩散下结晶。储液罐溶液含有100 mM氯化钠、100 mM硫酸锂、100 mM柠檬酸钠(pH值5.5)、25%聚乙二醇(PEG)1000和0.125%聚乙二醇400。对晶体的SDS-PAGE分析表明,它们不含α亚基。在上海同步辐射设施光束线BL17U1上收集了分辨率为4.4Å的衍射数据集,波长为0.979Å,并使用HKL2000软件包进行处理(奥特维诺夫斯基和小调,1997年).该晶体属于空间群C2221不对称单元中含有3 β和3 γ亚基。采用MOLREP分子置换法(Vagin和Teplyakov, 1997年),使用Cryo-EM结构作为搜索模型。结构细化与Phenix进行。

等温滴定量热法

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在25℃下对ITC 200仪器(MicroCal)进行ITC实验。进入β亚基取代对钠结合的影响,将OAD βγ亚配合物交换到含有100mm磷酸钾(pH 6.5)和0.02% DDM的溶液中。为了了解pH值和缓冲液对钠结合的影响将OADβγ亚络合物交换成含有20mm的指定缓冲液,100mM氯化钾和0.02%DDM的溶液中。本研究中使用的缓冲液是MES pH 5.55,MES pH 5.75,Tris pH 8.45,柠檬酸pH 5.79,MES pH 5.79,BIS-TRIS pH 5.79,PH 7.2,HEPES pH 7.2,TRIS pH 7.2,HEPES pH 8.2,TricinepH 8.2和Tris pH8.2。盐酸和四甲基铵氢氧化铵用于调节pH。表征钠结合,将浓度为120 μM的OAD βγ亚配合物转移到200 μl的细胞中。在匹配的缓冲液中加入50 mM的氯化钠溶液,每次2 μl注入细胞。

使用原点7.0(orighorlab)分析ITC数据。OADβ亚基含有两个钠结合位点(Jockel等,2000b),从我们的结构(图4B.).然而,我们ITC实验的热图似乎是单相的,这使得数据拟合多个结合位点变得困难(布劳提根,2015).我们将数据拟合到一组位点模型,化学计量数固定为2。在我们的ITC实验中,怀斯曼c参数明显小于1,由于难以集中,很难增加OAD βγ亚配合物样品。在这种情况下,将化学计量数固定为已知值可以抑制数据拟合,得到更准确的结果(Turnbull和Daranas,2003).

草酰乙酸催化脱羧OAD.

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草酰乙酸脱羧监测由草酰乙酸在265 nm的吸收变化(消光系数:0.95 mM)−1厘米−1)(Dimroth 1986)使用ultraspec 2100 pro分光光度计(GE Healthcare)。光路长度为1厘米。这个将OADβγ亚络合物交换成含有100mM磷酸钾(pH6.5)和0.02%DDM的缓冲液中。反应混合物含有300mM Tris pH 7.5,2mM的草酰胺,0.79μm6x组氨酸标记OADα亚基,5μm指示浓度下的OAD βγ亚络合物和氯化钠。数据分析采用QTIPLOT (www.qtiplot.com.).比活度定义为反应速度除以反应量旁边。测定半最大活度时的钠浓度(C1/2)和最大特定活动(v马克斯),数据拟合公式如下:

V V m 一个 X V 0 C + C O 一个 D + C 1 / 2 C + C O 一个 D + C 1 / 2 2 4 C C O 一个 D 2 C O 一个 D + V 0

等式代表的附加符号用于特定活动(v),零钠浓度的特异性活性(v0),钠浓度(c),OAD浓度(cOAD.).通过假设这一方程来推导钠饱和的OAD具有最大比活度V马克斯和钠结合OAD与A.Kd等于C1/2

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决定书

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    美国国立卫生研究院国家心脏、肺和血液研究所评论编辑
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    美国国立卫生研究院神经疾病和中风研究所高级编辑
  3. 局域网关
    评论家;德克萨斯理工大学健康科学中心,美国

为了透明度的利益,Elife出版了最实质性的修订请求和随附的作者回复188bet体育电竞。

验收总结:

我们兴奋地发表这项研究,我们相信它展示了一个令人着迷的一个膜蛋白系统,proton-dependent酶促反应和sodium-proton反向转运机制成为结构耦合产生一个更复杂的生物功能,进化是厌氧微生物的生物能学的关键。

决定信同行评审后:

感谢您将文章“通过草酰乙酸脱羧酶钠泵转化为钠运输”,以供考虑188bet体育电竞.您的文章已由三个同行评审员审核,评估由JoséD.Faraldo-Gómez监督审查编辑和Kenton Swartz作为高级编辑。审稿人#2已同意揭示她的身份(Lan Guan)。审稿人#1和#3选择了保持匿名。

审稿人相互讨论了这些评论,审稿人起草了这个决定,以帮助您准备修改后的提交。

简介:

在其他必要的代谢和膜运输过程中,许多微生物利用钠离子的跨膜电化学梯度,而不是质子,为ADP的循环转化为ATP提供动力。在这里,Xiang和他的同事报告了一种细菌蛋白复合物的部分结构,其功能就是产生这种钠+梯度,通过构象循环,使脱羧与NA的脱羧反应+跨膜易位。具体来说,该手稿描述了草酰乙酸脱羧酶(OAD)复合物的β和γ提交的低温电子显微镜结构。OAD络合物将草酰乙酸脱羧成丙酮酸。这个化学过程以某种方式导致钠挤压过膜。以这种方式,草酰乙酸的分解代谢被用来驱动钠梯度的产生。到目前为止,OAD的分子机制仍然是一个谜。这份手稿描述了这个谜题的一个重要部分。有趣的是,β亚基的结构与其他属于CPA/AT超家族的二级活性转运蛋白高度相似。更具体地说,OAD的结构与柠檬酸钠偶联体(CitS)最相似。CitS的结构已被确定为多种构象,并已被证明是由电梯交替存取机制运行。 Based on this structural similarity, a mechanism for OAD is proposed. Combined with functional and binding assays, this study constitutes a significant advancement in our understanding of this class of systems, and will no doubt foster new experimental and theoretical work. The study was perceived by reviewers as technically sound, scientifically rigorous, and presented logically. These merits notwithstanding, reviewers and editors agree that key aspects of the study require further development before the manuscript can be accepted for publication in188bet体育电竞

必要的修正:

1)作者必须证明功能分析中使用的突变体是良好折叠的(凝胶过滤痕迹)。

2)图6中概述的机制模型描述了两个非常不同 - ,看似矛盾的过程。当运输器面向外观时,释放NA+允许识别外部质子;Na的结合+和H+因此,这种状态被含蓄地假定为具有竞争性,就像传统的钠-质子反转运体一样。然而,该模型假设了一些非常不同的东西,面向内的构象,即Na+必须与H并发绑定+只有在羧基生物素脱羧后,H+释放(即转移到生物素)。如果得到证实,罗+和H+与同一转运体结合在一种构象中可能是协同的,但在另一种构象中可能是竞争的,这是相当了不起的。因此,我们认为这一因素需要进一步分析。正如其他结合钠的膜蛋白系统所证明的那样+和H+(Leone等人,2015年; Hariharan和Guan,2017),ITC实验精心设计,以尽量减少初始NA+在不同的pH值和/或不同的质子化焓缓冲液中进行的污染,可以令人信服地探测Na是否结合+和H+是协同的还是竞争的,在某些情况下,显示它们的化学计量比。似乎作者用ITC初步检测的纯化蛋白样品反映了在低温电镜图像中观察到的相同构象,即β亚基向内的状态。因此,作者应该继续进行这种类型的实验,特别是对于WT,如果可能的话,也应该对选定的突变体(例如Glu40)进行实验,并将他们的结果与图6中概述的假设进行对比。使用三盐酸缓冲液可能有助于测定钠+和H+绑定是相互依赖的。

3) ITC结果应包括热图,可作为补充信息显示。另外,请说明钠的化学计量数+是用来配合(在所有情况下)的,什么理由来证明这个选择?

4)作者似乎透明于,OAD的β亚基被认为类似于在运输商分类数据库(http://www.tcdb.org/search/result.php中的其他CPA运输车(http://www.tcdb.org/search/result.php?Tc = 3.b.1)和维基百科(Https://en.wikipedia.org/wiki/sodium transporting_carboxylic_acid_decarboxylase)。OAD的β亚基的结构是有趣的,但主要问题是草乙酸酯对丙酮酸的脱羧与Na相连+运输吗?这份手稿似乎没有回答这个问题,因为OAD的α亚基不能共同纯化来进行结构测定。作者应该更清楚地说明这项研究中哪些“有”哪些“没有”。在现实中,作者提出了一种电梯交替进入机制,这是从观察到的柠檬酸转运蛋白CitS和更遥远的相关Na+/H?换热器(188bet体育电竞2015年4:e09375;科学报告2017 7:2548)。作者应该更清楚地说明这一点,因为图6中提出的机制似乎很大程度上是基于先前在不同构象中捕获的OAD β亚基的结构同源物。

[编者注:在接受之前建议进一步修订,如下所述。]

感谢您再次提交您的文章“草酰乙酸脱羧酶钠泵对钠转运的结构洞察”188bet体育电竞.你修改后的文章已经由三位对原版本进行评估的专家进行了审查,评估由资深编辑肯顿·斯沃茨监督。审查人员选择匿名。

审稿人相互讨论了这些评论,审稿人起草了这个决定,以帮助您准备修改后的提交。

我们希望提请大家注意我们为应对COVID-19而作出的修订政策的变化(//www.danecarr.com/articles/57162)。188bet体育电竞具体来说,我们要求编辑们立即接受像你这样的稿件,他们认为可以作为188bet体育电竞论文没有额外的数据,即使他们觉得他们会使手稿更强大。因此,下面要求的订正只涉及清晰度和表述。

简介:

在其他必要的代谢和膜运输过程中,许多微生物利用钠离子的跨膜电化学梯度,而不是质子,为ADP的循环转化为ATP提供动力。在这里,Xiang和他的同事报告了一种细菌蛋白复合物的部分结构,其功能就是产生这种钠+梯度,通过构象循环,使脱羧与NA的脱羧反应+跨膜易位。具体来说,该手稿描述了草酰乙酸脱羧酶(OAD)复合物的β和γ提交的低温电子显微镜结构。OAD络合物将草酰乙酸脱羧成丙酮酸。这个化学过程以某种方式导致钠挤压过膜。以这种方式,草酰乙酸的分解代谢被用来驱动钠梯度的产生。到目前为止,OAD的分子机制仍然是一个谜。这份手稿描述了这个谜题的一个重要部分。有趣的是,β亚基的结构与其他属于CPA/AT超家族的二级活性转运蛋白高度相似。更具体地说,OAD的结构与柠檬酸钠偶联体(CitS)最相似。CitS的结构已被确定为多种构象,并已被证明是由电梯交替存取机制运行。 Based on this structural similarity, a mechanism for OAD is proposed, whereby the catalytic reaction powers the translocation of Na+利用H+在这个过程中。因此,该系统不同于通过ATP水解激发的初级活性离子转运蛋白,也不同于通过离子下坡吸收激发的大多数次级活性转运蛋白。与功能和结合分析相结合,这项研究构成了我们对这类系统理解的重大进步,无疑将促进新的实验和理论工作。评论家认为这项研究在技术上是合理的,在科学上是严谨的。尽管有这些优点,评审员和编辑一致认为该研究的关键方面需要进一步发展,并邀请进行修订。审稿人发现修改后的手稿有所改进。然而,一些结果的解释和讨论仍然是关键问题。目前不需要新的实验数据,但强烈鼓励作者进行旨在揭示脱羧反应位置的实验。

必要的修正:

1)新提供的ITC数据探测NA之间的相互作用+和H+,最有可能是向内的状态,这强烈表明这些离子竞争相同的结合位点,就像在传统的Na+/H中一样+与该系统密切相关的反毒剂。然而,根据该键发现,既不在图6中呈现的机械图或相关文本似乎已经被改变。从ITC数据源的竞争模型意味着状态2实际上并不像绘制一样存在,即与两个NA的面对的状态+和H+同时绑定。相反,新数据表明,遵循状态1的状态必须是本NA之前(蛋白质或溶剂中的脱羧位点或其他质子缓冲位点)的状态+离子可以结合。这将为作者对循环中随后的步骤的自身描述类似,对于外面的状态,即na+在质子在状态5和状态6之间结合之前从状态5和状态4之间脱落。作者必须纠正他们的方案和解释,使其与最新提供的ITC数据一致——这正是为了挑战竞争发生在外部状态而不是内部状态的概念。

2)在球状蛋白质中(例如,大肠杆菌羧基-生物素脱羧反应似乎需要生物素在一个大区域界面上的广泛协调,并进一步通过几个金属离子介导(Waldrop etal ., 2012)。在缺乏结合底物的直接证据的情况下,声称酶的反应发生在钠结合腔内(图5)似乎太过推测,应该这样讨论,概述替代解释和可能的方法来澄清这个问题。例如,反应在低聚化界面中发生似乎是合理的。值得注意的是大肠杆菌生物素羧化酶在没有生物素的情况下与ATP形成复合物。通过类比,未来的实验可以分析和识别OAD中的核苷酸结合位点。

3)我们强烈鼓励作者修剪稿件,专注于主要科学贡献,并提高其可读性。文本可能更简洁的可能部分包括引言,例如,关于Oad家族中其他成员的拓扑差异或讨论的序言;同样,在结果中,目前尚不清楚通过比较βOAD中的支架结构域来获得哪些机械洞察力和这些蛋白质的不同低聚;本节可以完全简洁或省略 - 如果需要,在补充数据标题中添加到补充数据。最后,在讨论中,在提前提出的结构分析存在一些重复。

https://doi.org/10.7554/188bet体育电竞eLife.53853.sa1

作者响应

必要的修正:

1)作者必须证明功能分析中使用的突变体是良好折叠的(凝胶过滤痕迹)。

我们添加了图1 -图2来显示凝胶过滤痕迹。突变体的行为类似于凝胶过滤柱上的野生型复合体,这表明它们是折叠良好的。

2)图6中概述的机制模型描述了两个非常不同 - ,看似矛盾的过程。当运输器面向外观时,释放NA+允许识别外部质子;Na的结合+和H+因此,这种状态被含蓄地假定为具有竞争性,就像传统的钠-质子反转运体一样。然而,该模型假设了一些非常不同的东西,面向内的构象,即Na+必须与H并发绑定+只有在羧基生物素脱羧后,H+释放(即转移到生物素)。如果得到证实,罗+和H+与同一转运体结合在一种构象中可能是协同的,但在另一种构象中可能是竞争的,这是相当了不起的。因此,我们认为这一因素需要进一步分析。正如其他结合钠的膜蛋白系统所证明的那样+和H+(Leone等人,2015年; Hariharan和Guan,2017),ITC实验精心设计,以尽量减少初始NA+在不同的pH值和/或不同的质子化焓缓冲液中进行的污染,可以令人信服地探测Na是否结合+和H+是协同的还是竞争的,在某些情况下,显示它们的化学计量比。似乎作者用ITC初步检测的纯化蛋白样品反映了在低温电镜图像中观察到的相同构象,即β亚基向内的状态。因此,作者应该继续进行这种类型的实验,特别是对于WT,如果可能的话,也应该对选定的突变体(例如Glu40)进行实验,并将他们的结果与图6中概述的假设进行对比。使用三盐酸缓冲液可能有助于测定钠+和H+绑定是相互依赖的。

我们已经用野生型和E40a进行了建议的ITC实验OAD βγ亚配合物表明,pH值的增加增加了钠与βγ亚配合物的亲和力。我们增加了晶体学的研究OAD βγ亚配合物也捕获了向内开放构象中的β亚基。我们的晶体学和冷冻电镜研究分别在pH 5.5和7.5下进行,表明在我们的实验条件下,在较大的pH范围内,内向开放的构象是首选的。总之,ITC和结构数据表明,钠和质子竞争结合到向内开放的β亚基的负电荷口袋。在审稿人引用的研究中(Hariharan和Guan, 2017;Leone, Pogoryelov, Meier, and Faraldo-Gomez, 2015),发现钠结合焓和缓冲质子化焓之间存在很强的相关性。在这些研究中,质子通过竞争性的钠结合从蛋白质中释放出来。它随后与缓冲分子的结合有助于这种相关性。这种相关性可以估计钠/质子的化学计量比。在我们的实验中,没有观察到这种关联,这表明释放的质子中有很大一部分没有与缓冲分子结合。在我们的ITC实验中,β亚基包含一个溶剂暴露的四个组氨酸残基簇,它可能与释放的质子结合。 We have added a “Effect of pH on Sodium binding to the“OADβγ亚复合体”一节来描述这些实验。我们还对讨论进行了修改,以讨论这些新实验对OAD机制带来的见解。

3) ITC结果应包括热图,可作为补充信息显示。另外,请说明钠的化学计量数+是用来配合(在所有情况下)的,什么理由来证明这个选择?

我们添加了图4 -图补充1和图5 -图补充1来显示热图。据报道,OAD β亚基包含两个钠结合位点(Jockel, Schmid, Steuber,和Dimroth, 2000),我们的结构表明,它们可能并不相同(图4B)。然而,我们ITC实验的热图似乎是单相的,这使得使用不止一组结合位点进行数据拟合变得困难(Brautigam, 2015)。我们用一组站点模型拟合ITC数据。在我们的ITC实验中,浓度OAD βγ亚复合物(120mm)明显小于Kd(在毫摩尔范围内)并且由于样品浓缩困难而不能显著增加。这使得怀斯曼c参数小于1,在这种情况下,将化学计量数固定为已知数可以抑制数据拟合,以获得更准确的结果(Turnbull和Daranas, 2003)。我们将化学计量数固定为2,因为β亚基包含两个钠结合位点。我们已经修改了材料和方法部分的相关段落,以包括上述讨论。

4)作者似乎透明于,OAD的β亚基被认为类似于在运输商分类数据库(http://www.tcdb.org/search/result.php中的其他CPA运输车(http://www.tcdb.org/search/result.php?Tc = 3.b.1)和维基百科(Https://en.wikipedia.org/wiki/sodium transporting_carboxylic_acid_decarboxylase)。OAD的β亚基的结构是有趣的,但主要问题是草乙酸酯对丙酮酸的脱羧与Na相连+运输吗?这份手稿似乎没有回答这个问题,因为OAD的α亚基不能共同纯化来进行结构测定。作者应该更清楚地说明这项研究中哪些“有”哪些“没有”。在现实中,作者提出了一种电梯交替进入机制,这是从观察到的柠檬酸转运蛋白CitS和更遥远的相关Na+/H?交易所(Elife 20188bet体育电竞15 4:E09375;科学报告2017 7:2548)。作者应该更清楚地说明这一点,因为图6中提出的机制似乎很大程度上是基于先前在不同构象中捕获的OAD β亚基的结构同源物。

我们在“结构的结构”中修订了第三段“OAD β亚基”部分引用了之前的研究,这些研究表明OAD β亚基和CPA2家族成员之间存在同源性。我们同意评论者的观点,即我们目前的研究没有回答关于OAD功能的许多重要问题,包括草酰乙酸脱羧如何与钠转运耦合,以及“提升机制”主要是基于与其他转运体的结构同源性,需要验证和改进。我们在讨论部分增加了最后一段,讨论当前研究的局限性以及未来需要进行哪些研究。我们认为,为了充分了解OAD的分子机制,未来需要对反应周期不同阶段β亚基和OAD全酶的结构进行进一步研究。

[编者注:在接受之前建议进一步修订,如下所述。]

必要的修正:

1)新提供的ITC数据探测NA之间的相互作用+和H+,最有可能是向内的状态,这强烈表明这些离子竞争相同的结合位点,就像在传统的Na+/H中一样+与该系统密切相关的反毒剂。然而,根据该键发现,既不在图6中呈现的机械图或相关文本似乎已经被改变。从ITC数据源的竞争模型意味着状态2实际上并不像绘制一样存在,即与两个NA的面对的状态+和H+同时绑定。相反,新数据表明,遵循状态1的状态必须是本NA之前(蛋白质或溶剂中的脱羧位点或其他质子缓冲位点)的状态+离子可以结合。这将为作者对循环中随后的步骤的自身描述类似,对于外面的状态,即na+在质子在状态5和状态6之间结合之前从状态5和状态4之间脱落。作者必须纠正他们的方案和解释,使其与最新提供的ITC数据一致——这正是为了挑战竞争发生在外部状态而不是内部状态的概念。

为了更好地解释新的ITC数据,我们修改了图6B和讨论部分的第二和第三段。我们已经从图6B中删除了状态2,它与我们的新ITC数据不一致。钠和质子的竞争性结合表明钠可能促进质子释放以进行羧基生物素脱羧,我们已经在讨论部分的第二段包含了这个讨论。

2)在球状蛋白质中(例如,大肠杆菌生物素羧化酶)羧-生物素脱羧反应似乎需要生物素在大区域界面上的广泛协调,并进一步通过几个金属离子介导(Waldrop etal . 2012)。在缺乏结合底物的直接证据的情况下,声称酶的反应发生在钠结合腔内(图5)似乎太过推测,应该这样讨论,概述替代解释和可能的方法来澄清这个问题。例如,反应在低聚化界面中发生似乎是合理的。值得注意的是大肠杆菌生物素羧化酶在没有生物素的情况下与ATP形成复合物。通过类比,未来的实验可以分析和识别OAD中的核苷酸结合位点。

我们同意我们的假设是投机性,也无法排除其他可能性。我们已经修改了“对钠结合的pH值的影响“OAD βγ亚配合物”节和Discussion节中的第二段进行了说明。我们还修改了讨论部分的最后一段,指出需要对羧基生物素脱羧所需底物复合物中b亚基的结构研究,以确定该反应的位置并了解其机理。生物素羧化酶将ATP水解与羧基从重碳酸盐转移到生物素。然而,OAD的生物素羧化和羧-生物素脱羧都不需要ATP或其他核苷酸。我们目前还没有任何关于OAD反应涉及到核苷酸的报道。

3)我们强烈鼓励作者修剪稿件,专注于主要科学贡献,并提高其可读性。文本可能更简洁的可能部分包括引言,例如,关于Oad家族中其他成员的拓扑差异或讨论的序言;同样,在结果中,目前尚不清楚通过比较βOAD中的支架结构域来获得哪些机械洞察力和这些蛋白质的不同低聚;本节可以完全简洁或省略 - 如果需要,在补充数据标题中添加到补充数据。最后,在讨论中,在提前提出的结构分析存在一些重复。

我们赞赏这个建议,并在建议的地方修剪了稿件。

https://doi.org/10.7554/188bet体育电竞eLife.53853.sa2

文章和作者信息

作者详细信息

  1. 鑫徐

    天津医科大学生物化学与分子生物学教研室,免疫微环境与疾病教育部重点实验室,天津
    贡献
    调查
    了同样的
    huigang shi.
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
  2. huigang shi.

    1. 中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验室,中国科学院卓越生物大分子研究中心,北京
    2. 中国科学院大学,北京
    贡献
    调查
    了同样的
    鑫徐
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
  3. 晓文龚

    中国科学院上海生物科学研究院营养代谢与食品安全重点实验室,上海营养与健康研究所,上海
    目前地址
    Bio-X院校,发育和神经精神障碍遗传学的重点实验室(教育部),上海交通大学,中国上海
    贡献
    调查
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
  4. 普辰

    天津医科大学生物化学与分子生物学教研室,免疫微环境与疾病教育部重点实验室,天津
    贡献
    调查
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
  5. 应高

    中国科学院上海生物科学研究院营养代谢与食品安全重点实验室,上海营养与健康研究所,上海
    贡献
    监督、调查、项目管理
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
  6. 新郑张

    1. 中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验室,中国科学院卓越生物大分子研究中心,北京
    2. 中国科学院大学,北京
    贡献
    监督、调查、项目管理
    为对应
    xzzhang@ibp.ac.cn
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
  7. 宋祥

    天津医科大学生物化学与分子生物学教研室,免疫微环境与疾病教育部重点实验室,天津
    贡献
    概念化、数据整理、正式分析、监督、资金获取、验证、调查、可视化、方法学、项目管理
    为对应
    xiangsong@tmu.edu.cn
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
    orcid图标 “此Orcid ID标识本文的作者:”0000-0001-9314-4684

资金

中国国家自然科学基金(31870769)

  • 宋祥

中国国家自然科学基金(31570743)

  • 宋祥

资助方没有参与研究设计、数据收集和解释,也没有决定是否将研究提交出版。

确认

感谢上海同步辐射设备beam BL17U1、中国科学院生物物理研究所蛋白质科学核心设施生物成像中心、黄晓军、朱伯玲、季刚、张晓军、张晓军、张晓军、张晓军、张晓军、张晓军、张晓军。中国科学院植物生理与生态研究所张鹏研究员,中科院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学核心实验室,中科院生物化学与细胞生物学重点实验室,中科院生物化学与细胞生物学重点实验室,中科院生物化学与细胞生物学重点实验室协助中国科学院动态光散射和ITC实验。基金资助:国家自然科学基金面上项目(no . 31870769, no . 31570743)。

高级编辑

  1. Kenton J Swartz,美国国立卫生研究院神经疾病和中风研究所

检查编辑器

  1. José D Faraldo-Gómez,美国国家卫生研究院国家心肺和血液研究所

审稿人

  1. 兰关,德克萨斯理工大学健康科学中心,美国

出版的历史

  1. 收稿日期:2019年11月22日
  2. 录用日期:2020年5月22日
  3. 已接受的稿件已发布:2020年5月27日(版本1)
  4. 出版版本:2020年6月5日(版本2)

版权

©2020,Xu等人。

这篇文章是在知识共享署名许可协议,在注明原作者和出处的情况下,允许无限制地使用和再发行。

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