1. 生物化学与化学生物学
  2. 结构生物学与分子生物物理学
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端粒酶选择核苷酸的机制

  1. 马修一个Schaich
  2. 萨曼莎·L·桑福德
  3. 格里芬一个韦尔夫
  4. 塞缪尔•约翰逊
  5. 星期四H Khoang
  6. 帕特里夏·L Opresko
  7. 布雷特·D戴夫 是通讯作者
  1. 美国堪萨斯大学医学中心生物化学和分子生物学系
  2. 美国匹兹堡大学公共卫生研究生院环境和职业健康系,匹兹堡大学医学院希尔曼癌症中心
  3. 美国堪萨斯大学医学中心癌症生物学系
研究文章
引用本文为:188bet体育电竞eLife 2020; 9: e55438 doi:10.7554 188bet体育电竞/ eLife.55438

摘要

端粒酶延伸染色体末端的端粒序列以保护基因组DNA。在这一过程中,它必须从具有各种糖和碱基配对性质的核苷酸库中选择正确的核苷酸,这对于shelterin正确地覆盖端粒序列至关重要。不幸的是,端粒酶如何选择正确的核苷酸尚不清楚。在这里,我们确定了种有害castaneum端粒酶逆转录酶(TERT)的整个催化循环,并绘制了负责核苷选择、金属配位、三磷酸结合和RNA模板稳定的活性位点残基。我们发现,TERT分别在10,000个插入事件中插入~1和14,000个插入事件中插入~1个不匹配或核糖核苷酸。在生物核糖核苷酸浓度下,这些速率转化为每10个碱基插入约40个核糖核苷酸。人类端粒酶测定确定了一个保守的酪氨酸空间门调节核糖核酸插入端粒。我们的工作为端粒酶如何选择适当的核苷酸来维持端粒的完整性提供了深入的了解。

介绍

在真核细胞的每一轮分裂中,每条染色体的末端都会丢失少量的DNA (Olovnikov 1973沃森,1972年).这种现象被称为末端复制问题,可以通过两种互补的适应来应对。首先,在染色体末端发现了重复的非编码DNA序列,即端粒,防止了在每次细胞分裂期间重要遗传信息的丢失(布莱克本和加尔,1978年Moyzis等人,1988年)第二,核糖核蛋白端粒酶利用逆转录酶活性拉长染色体末端缩短的端粒(葛瑞德和布莱克本,1987年).如果没有伸长,端粒最终会变得非常短,导致细胞凋亡或衰老(Hayflick和Moorhead,1961年迈尔森,1998年).因为端粒酶在细胞分裂的时间调节中起如此基本作用,端粒酶中的像差均涉及许多人类疾病。这些包括过早的老化,特发性肺纤维化(IPF),脱诊剂同胞和癌症(布拉斯科,2005年Kim等人,1994年Nelson和Bertuch, 2012年).特别是〜90%的癌症上调端粒酶对抗聚端身缩短并使无限细胞分裂能够与体细胞缺失(Jafri等人,2016年).

端粒酶在多种人类疾病中的意义强调了在分子水平上理解其催化循环的重要性。虽然人类端粒酶全酶由多个附属亚基组成,但催化作用局限于端粒酶逆转录酶(TERT)亚基(Nguyen等人,2018年).历史上,人类TERT的生化特征(HTERT)已被证明具有挑战性,部分原因是纯化和重组大量活性端粒酶(Ramakrishnan等人,1997年施密特等人,2016年)因此,许多描述端粒酶催化循环的基本参数尚未确定。这些酶常数对于理解活性位点残基的作用、从错误核苷酸中选择正确的核苷酸(保真度)以及防止核糖核苷酸三磷酸(rNTP)插入至关重要端粒的端粒酶忠实延伸是至关重要的,因为端粒序列的畸变阻止了shelterin蛋白覆盖端粒,从而促进了基因组的不稳定性(2005年德兰格南达库马尔等,2010年).人类端粒酶的结构研究在历史上也具有挑战性。目前,人类端粒酶最高分辨率的结构快照是8Å分辨率的cryo-EM结构(Nguyen等人,2018年).该结构是端粒酶结构生物学的一个里程碑,揭示了端粒酶三级和二级结构的细节。然而,在这种分辨率下,氨基酸的位置很难区分,使得催化循环的许多分子细节模糊不清。

为了减轻人端粒酶生化表征中固有的困难,已经建立了几种模型系统。这些包括来自酵母的模型,proTazoa四膜虫thermophila(最近确定了5 Å低温- em结构)和昆虫模型种有害castaneum序列对齐显示在图1 -图补充吉利斯等人,2008年江等人,2018Petrova等人,2018年).对于TERT的生化特性,我们选择使用栗树泰特(tcTERT),原因如下:第一,tcTERT很容易适应低温电磁密度HTERT和最近的低温电镜结构吻合得很好t . thermophila,突出保存完好的二级结构(图1 -图补充);第二,在与HTERT,口袋的活动站点tcTERT具有高度的序列一致性(补充文件1,表1);第三,使用截短版本的栗树端粒酶RNA组分(TR),我们可以很容易地获得足够数量的分离、活性tc通过预稳态动力学和x射线晶体学表征端粒酶催化循环的TERT (吉利斯等人,2008年Nguyen等人,2018年).虽然TERTs具有高度保守的活性位点,但人类与TERTs之间的域结构发生了显著变化tc叔。这些包括tcTERT缺失n端(TEN)结构域,部分插入手指结构域(IFD)缺失(补充文件1表1 b)。这些结构域对于其他端粒酶同源物的活性是必不可少的,并且已经被假设对端粒酶在易位过程中的棘轮尤为重要(Steczkiewicz等人,2011年).因此,我们保持了我们的tcTERT动力学在一个单一的周转(即插入)制度,并且,在可能的情况下,补充动力学结果与人类端粒酶研究,以表征端粒酶的催化循环。利用这种联合方法,我们阐明了端粒酶活性位点残基的作用,并确定了保真度和rNTP判别机制。

结果

端粒酶的TERT亚基通过一个保守的催化循环延长端粒DNA,如中所述图1一个图1 -图补充首先,端粒酶将其RNA模板退火到端粒DNA末端,形成二元复合物(TERT:DNA,图1一个,国家1).接下来,二进制复数绑定进入的DNTP和用于适当的Watson-Crick基础对RNA模板的样本(图1一个B、州1).这两个状态之间的转变代表了核苷酸结合的步骤,以解离常数(KD).如果得到的三元配合物(TERT:DNA:dNTP)在正确的方向上,TERT将催化磷酸二酯键的形成,并将端粒延长一个核苷酸(图1一个C、州1).这两种状态之间的转变是化学步骤,其饱和核苷酸浓度的理论最大速率被描述为k波尔.在插入进来的核苷酸后,端粒酶将转移注册表,使活性位点与下一个模板碱基(形成状态A2).该核心催化循环重复六次,直至加入新的细胞重复(图1一个C、州6)添加一个端粒重复序列所需的所有18种端粒状态如所示图1 -图补充供参考。重要的是,当端粒酶接近其模板的末端时,位于5 '端的DNA:RNA双链开始熔化,使得端粒酶可以(1)将RNA成分转移并退火到新扩展的端粒重复序列中,从而允许额外的重复添加;或(2)从端粒DNA分离。一个端粒酶穿过这个催化循环的次数是受到严格控制的。最近的研究表明,端粒酶在两次重复后变得不活跃,但可以被最近发现的细胞内端粒酶激活因子(iTAFs)重新激活(赛义德等人,2019年).

端粒酶催化循环及其第一结构状态。

一个端粒酶催化循环概述。端粒酶形成一个核苷酸前结合的二元复合物(状态a1).然后,它结合进来的三磷酸核苷酸形成一个三元复合物(状态B1),通过化学方式将其连接到端粒末端(状态C1),然后将注册表转移结合下一个进入核苷酸(州A2).这个循环完成六次后(状态C6),端粒酶将要么分离要么发生易位(虚线),这将使其回到状态A1.(B)Tctert普伦核苷酸二元络合物。Tctert(浅橙色卡通和表面)环绕DNA(白色)和RNA(紫色)底物。(C)核苷酸前二元复合物的活性位点口袋。rC结合(灰色),dG结合残基(黄色),核苷残基(青色),催化残基(蓝色)和三磷酸结合(绿色)以棒的形式显示。(D) rC结合残基的特写图,(E)末端dG结合残基,(F)核苷结合残基,及G)的tcTERT催化残基和三磷酸配位残基。Mg2+离子显示为紫色球体,DNA显示为白色棒。

在分子水平上观察端粒的延伸

Pre-nucleotide二进制复杂

我们通过共结晶来确定TERT是如何与端粒DNA结合的tcTERT与一个16-mer RNA链杂交到它的互补的15-mer DNA链形成一个二元复合物。该底物模拟了最初与端粒DNA结合的TERT:RNA复合物(图1一个,国家6).在这个方向上,RNA链上的一个未配对的5 '胞嘧啶(rC)作为模板基,DNA链上的一个3 '腺苷(dA)作为引物末端(图1 b, C).这种复合物的晶体生长在P3中221空间组,衍射到2.5 Å分辨率(补充文件2由此产生的结构显示TERT作为一个环结合在RNA:DNA复合物的末端,其活性位点位于DNA链的末端(图1 b, C).

在TERT活性位点内,模板RNA链由多个保守的tcTERT残基稳定(补充文件1,表1)。残基I196, V197, S198, G309和R194在模板RNA碱基周围组成一个口袋(图1 d).这个口袋使用极性和非极性相互作用来稳定模板rC的构象,使其沃森-克里克边缘指向进入的核苷酸结合位点。在另一侧,引物末端3 ' -dA的3 ' -OH指向催化金属结合位点,T341和V342的侧链与3 ' -dA的脱氧核糖糖部分进行非极性相互作用(图1 e补充文件1,表1)。这个二元TERT复合物在活性位点上也有一个空洞,形成核苷酸结合袋。这些核苷酸口袋残基可细分为三类:核苷配位残基、催化残基和三磷酸相互作用残基(图1F和G).值得注意的是,组成这三个基团的残基之间是100%保守的H叔和tc泰特(补充文件1,表1a)。核苷结合基团由残基R194、Y256和Q308组成(图1 f).这些残基在端粒DNA的引物端上游形成一个核苷形状的裂口,下面进一步描述。催化残基包括催化三元组:D251、D343和D344。这些残基在催化过程中配合二价金属离子(图1 g).残基K189、A255、N369和K372的主链能够与传入核苷酸的三磷酸形成相互作用(图1 g).总的来说,活跃的部位tcTERT被引物用于核苷酸结合,参与结合的残基在人类端粒酶中高度保守(补充文件1,表1)。

核苷酸结合三元复合物

我们还确定了TERT的结构后,结合一个传入的核苷酸,但之前催化(图1一个B、州6).为了捕获这个三元配合物,我们使用了一个不可水解的核苷酸类似物2'-脱氧鸟苷-5'-[(α,β)-亚甲基]三磷酸(dGpCpp)。dGpCpp与dGTP相同,除了α和β磷酸之间的桥接氧是一个碳原子,这阻止了催化作用(Batra等人,2006年Gleghorn等人,2011年).这种复合物的晶体生长在同一个P3中221个空间群,衍射到2.9 Å分辨率(补充文件2表2)。将该三元配合物与二元状态(RMSD值为1.52 Å,图2一个)表示TERT与dGpCpp结合所需要的结构重排最少。组成核苷酸前二配体的核苷酸结合袋的活性位点残基与进入的dGpCpp配合,使其沃森-克里克面与模板rC (图2 b, C).两个毫克+2离子表现出八面体配位,以促进核苷酸结合。催化金属坐标残留物D251,D343,D344,引物末端的3'-OH,以及DGPCPPα-磷酸的非桥接氧气(图2 d).核苷酸金属配合D251和D343的侧链,I252的主羰基,以及进入dGpCpp的α,β和γ磷酸盐上的非桥接氧(图2 d).核苷结合残基R194保持在与它在核苷酸前态相似的位置,但现在在残基Q308和传入核苷酸的α磷酸之间形成了一个连接网络,使其在靠近其他核苷结合残基的方向上稳定下来。Y256位于核苷脱氧核糖部分的C2位置附近,Q308与dGpCpp的核苷成分(图2 e).作为一个整体,核苷结合残基包围了传入核苷酸的核苷成分,并将其定位,使碱基可以与引物末端碱基堆叠。总的来说,这个三元复合物提供了对TERT选择核苷酸和核苷酸结合过程中活性位点残基的具体作用的了解。

TERT三元结构和产物结构。

一个tcTERT三元结构,与核苷酸前二元复合物重叠。DNA(白色),RNA(紫色),二元tcTERT(黄色图),三元tcTERT(蓝色图)。(B) tcTERT活动站点。核苷残基(青色),三磷酸残基(绿色)和催化残基(蓝色)显示。dGpCpp(黄色)、DNA和RNA用棍子表示。(C) dGpCpp的近景与堤岸省略地图的轮廓在σ = 3.0(绿色网格)。(D、E)dGpCpp触点显示为Mg2+(紫色)、催化残留物(海洋)和核苷残留物(青色)。(F) tcTERT产物结构(红色图),与核苷酸前二元复合物重叠(黄色图)。(G) tcTERT产品结构的活动站点视图。(H)在进入的dGpCpp(绿色网格)周围,在σ = 3.3绘制的圩田地图的显示。(催化残基(海洋)配合插入的dG(白色)。

产品复杂

为了捕获端粒酶的产物复合物,我们将TERT与其核酸底物和dGTP孵卵后结晶,让TERT插入核苷酸,形成催化循环的最终产物阶段(图1一个C、州6).在全球和活性位点内,我们观察到核苷酸前二元复合物和产物结构之间的最小结构变化(RMSD值为1.04 Å,图2 f).插入dG的电子密度表明其沃森-克里克面氢键与模板rC (图2G,H).模板rC继续与之前描述的其他两种结构状态(包括I196、V197、S198、G309和R194)中与之协调的残基相互作用。该结构中既没有发生注册表移位,也没有发生移位步骤;TERT活性位点与末端DNA碱基保持一致(图2我).将这个结构与催化循环中前几个阶段的结构进行比较,我们发现从催化循环的二元、三元和产物状态开始,需要最小的全局重排。

TERT的保真度和糖选择性

通过单核苷酸插入的稳态前动力学对端粒酶催化机理进行了表征tc泰特(图3图3 -图补充图3 -图补充补充文件3.).这些实验决定了KD输入的核苷酸和K波尔为核苷酸插入tcTERT,迄今为止证明人类端粒酶(或任何其他同源物)无法获得。在模板rC中插入正确匹配的dGTPK波尔1.05年代−1.和一个KD输入dGTP为18.1 μM (图3 a, D).这两个值可与其他非复制DNA聚合酶和TERT K相比较由稳态动力学得到的值(Brown et al., 2010陈等,2018).我们进一步探讨了tcTERT活性位点残基R194和Q308,因为它们在催化过程中的作用并不清楚,仅从结构上看,两个残基都突出到核苷酸结合口袋(图1 f补充文件1,表1)。对于TERT R194A,该K波尔下降28倍至0.0369秒−1.,KD对于dGTP,增加约5倍至93μM(图3 -图补充2A、C).对于Q308A变种,K波尔降低约60倍至0.30 s−1.KDdGTP增加~2倍至45 μM (图3 -图补充2B、D).因此,R194和Q308主要在化学步骤中发挥作用,而不是核苷酸结合。随着H与R194(R631,补充文件1,表1a)与IPF有关,我们推断R631位点的突变可能减少H叔的K波尔,导致IPF病变(Basel-Vanagaite等人,2008年Diaz de Leon等人,2010年).

TERT忠诚和糖的辨别。

一个) WT tcTERT插入与rC相对的dGTP的预稳态动力学。数据拟合方程1补充文件3.,表3a和b)。误差柱代表平均值的标准差。这些实验也通过WT tcTERT插入dATP从rC (B)及rC对面的rGTP (C).重新绘制数据图并进行匹配方程2都是为了(D)在rC对面的dGTP, (E) rC对面的dATP,及(F) rGTP对面的rC。(G) TERT核苷酸保真度(红线)与其他DNA聚合酶家族的比较。(H)显示了TERT的rNTP鉴别率(红线)与所选DNA聚合酶的比较(布朗和索,2011年麦卡洛克和昆克尔,2008年).

在端粒延伸过程中,端粒酶必须在多种核酸底物之间进行选择,才能恰当地维持端粒的完整性。为了探究端粒酶的保真度,我们应用预稳态动力学,评估TERT在端粒延伸过程中插入核苷酸的效率。研究人员检测了两种不同类型的核苷酸选择:(1)选择匹配的dGTP而不是不匹配的dATP,(2)选择匹配的脱氧核糖核酸三磷酸(dNTP)而不是匹配的rNTP (图3B及C补充文件3.我们观察到,在插入与模板rC相对的dATP时,无论是在核苷酸结合阶段还是化学阶段,其催化效率都明显低于dGTP插入。对于不匹配的插入,K波尔下降129倍至0.0081 s−1.KD增加76倍至1.3毫米(图3E).由此产生的催化效率(K波尔/KD)表示端粒酶在10000个核苷酸插入事件中会插入1个错误的核苷酸。与其他DNA聚合酶相比,端粒酶的碱基选择保真度适中(图3G).对于rNTP判别,K波尔插入rGTP的时间减少了281倍,为0.0037秒−1.KD增加49倍至0.89 mM (图3F).与dNTP相比,这导致rNTP插入的催化效率下降了近14000倍(即糖的区别,图3H).由于rNTP的细胞浓度平均约为dNTPs的50倍,这种糖的辨别表明端粒酶将在细胞环境中280个插入事件中插入rNTP ~1(见讨论)(Traut 1994).

端粒酶的空间栅极

高细胞浓度的rNTP导致大多数DNA聚合酶进化出一个结构保守的活性位点残基,通过降低rNTP插入率来提供糖的识别(布朗和索,2011年卡瓦诺等人,2010Nick McElhinny等人,2010年).这些残基被称为“空间门”,因为它们与进入的rNTP的2 ' -OH冲突。在整个TERT催化循环中,我们观察到Y256停留在DNA的小凹槽中,并与进入的rNTP的2 ' -OH发生冲突(图2 e).因此,我们假设这个残基是端粒酶的空间门。为了验证这一假设,我们使用TERT (图4 a, B).与WT TERT相比,Y256A的匹配RGTP的插入显示增加1,490倍K波尔5.5年代−1.而这一数字下降了12倍KD至73 μM (图4C).TERT Y256A插入匹配的dGTP的结果与rGTP的结果相似K波尔KD6.6年代−1.和74 μM (图4D).因此,TERT的糖选择性从WT TERT的rGTP和dGTP之间的14000倍下降到Y256A TERT变体的2倍以下(图4E).换句话说,一个单一的Y256A替换将rGTP插入效率提高了18000倍,几乎消除了所有的糖歧视。在细胞环境中,rNTPs的浓度远高于dNTPs, WT TERT插入rGTP的效率比dGTP低100倍以上。相比之下,TERT Y256A在蜂窝条件下插入rGTP的效率是dGTP的77倍(图4FTraut 1994).

TERT的空间门阻止rNTPs的插入。

tcTERT去除位阻门(即Y256A)的预稳态动力学(一个) rGTP插入和(B) dGTP插入(补充文件3.误差条代表平均值的标准偏差。这些图被重新填充并拟合方程2(C) tcTERT Y256A插入rGTP和(D) tcTERT Y256A插入dGTP (E)WT-TERT和TERT-Y256A插入dGTP(绿色)和rGTP(红色)的催化效率(kpol/Kd)的比较。(F根据细胞核苷酸浓度调整的TERT效率的比较。(G) TERT Y256A的核苷酸前二元复合物(绿色)与WT的TERT核苷酸前二元复合物结构(黄色)重叠。(H,我)所示为TERT Y256A的活性位点口袋,带有DNA(白色)、RNA(紫色)、催化残基(蓝色)和核苷配位残基(青色)(J与Y256A tcTERT(青色)相比,dGpCpp从三元结构(对齐并显示为黄色和绿色棒)的C2位置最近的接触。

接下来,我们验证了糖识别的消融是由于TERT活性位点的具体变化,而不是酶的整体重排。为了测试结构重排,我们结晶了TERT Y256A的核前二进制状态(状态A6),与WT蛋白相比,看到最小的结构差异(图4 g-j).引物末端位置不变,催化残基D251、D343、D344均在原位催化核苷酸转移酶反应(图4H).经进一步检查活性位点袋,以丙氨酸取代Y256导致更开放的核苷酸结合袋(图4H和I).从DGPCPP的C2碳转移到残留物256的距离从3.3埃在Tert Y256a中从3.3埃转移到5.7Å,表明Tert Y256a还有更多的空间来容纳2'-oh(图4J).综上所述,这些结果表明Y256与rNTPs的2 ' -OH冲突,提供糖的辨别功能,是端粒酶的空间门。

为了确定人类端粒酶是否使用类似的机制来区别rNTP插入,我们实施了人类端粒酶活性测定(习和切赫,2014年).在这些检测中,该序列有1.5个端粒重复TTAGGGTTAG与所有4个dNTPs或所有4个rNTPs的50µM孵育,并纯化3xFLAG标记的hTR过表达的人类端粒酶。我们用WT端粒酶和端粒酶Y717A变体进行了这些测试,Y717A是端粒酶的同源残基tcTert Y256。WT端粒酶在DNTPS存在下显示鲁棒底漆延伸,〜10%的底漆在30分钟内延伸到产品中(图5 a, B).同样地,Y717A变体在所有4个dNTPs中,在相同的时间内引物延伸率达到~7% (图5 a, B).相比之下,当我们将WT端粒酶与所有4个rNTPs而不是dNTPs孵育时,我们观察到30分钟后的引物延伸非常低(<1%),这表明人类端粒酶对rNTPs有区别,类似于tc泰特(图5 c, D).当我们对位阻门变体(Y717A)进行相同的端粒延伸实验时,我们观察到引物的延伸比WT增加了3倍H在rNTPs存在下的TERT (图5 c, D).这些结果表明Y717在H泰特(补充文件1表1a)是人类端粒酶的空间闸门。有趣的是,在WT和Y717A端粒酶中,观察到第一个端粒重复序列的最小插入,这表明端粒链中rNTPs的存在可能抑制端粒酶易位步骤(图5 c).

人类端粒酶的空间门。

一个) WT(左)和Y717A(右)人类端粒酶对所有4个dNTPs引物延伸的时间历程。(B)引物延伸百分数,蓝色线显示WT,红色线显示Y717A突变体。(C) WT端粒酶(左)和Y717A端粒酶(右)四个rNTPs引物延伸的时间历程。(D) C组凝胶结果,红色为突变端粒酶,蓝色为WT端粒酶。(E)来自WT(左)和Y717A端粒酶的引物延伸。每条车道包含所有四个dNTP,或三个dNTP和一个用红色标记的dNTP。(F)面板e中所选序列的前两个端粒重复序列的近距离图显示的是红色区域。每个带的定量百分比产品也显示和标记的端粒酶模板基的位置。用星号标记的碱基与溶液中的rNTP互补。误差棒表示四个生物重复的标准偏差。

接下来评估如果核苷酸混合物中的更细微改变也会导致端粒酶延伸的抑制。通过将一个rntp替换为核苷酸混合物,我们可以确定插入每重复(分别用RATP,RUTP和RGTP)插入一个,两种或三个RNTPS的效果。在每种情况下,端粒酶处理率降低,没有频段明显,经过第二端直角重复(图5 e).抑制效果似乎取决于每次重复插入的rNTPs的数量,其中rGTP的存在表现出最大的抑制作用。对于位阻门Y717A突变端粒酶,rNTPs对端粒酶加工的影响要小得多。在最极端的情况下,每个重复存在三个rNTPs,延伸产物明显进入第二次重复,而WT端粒酶几乎没有插入事件(图5 e).我们假设rGTP插入可以显著抑制WT端粒酶,因为在重复序列中的前两个插入是由rC模板化的。因此,第一个事件需要是rNTP插入,然后从可能不稳定的引物端插入另一个rNTP插入。我们无法解释抑制作用是由于每次重复的核糖核苷酸数量,还是序列依赖的抑制,还是两者的结合。与rGTP相反,当rATP存在时,端粒酶能够合并多个重复,尽管与dntp相比效率较低(图5 e).

在这些引物延伸活性分析中,rNTP插入的影响也可以在单核苷酸水平上观察到。对于WT端粒酶的rATP插入,我们观察到底物中比rNTP插入位点短一个核苷酸的积累,占总产物形成的60% (图5 f)这可以解释为端粒酶对rATP插入的催化效率低下,导致酶在rATP插入事件发生前直接停止。与WT端粒酶相反,Y717A变体在rATP插入事件中没有停滞。有趣的是,rNTPs抑制Y717A和WT端粒酶的易位,这意味着端粒酶具有超出单核苷酸结合水平的rNTP识别机制(图5 e, F).结果之间的协议tc叔和HTERT指出了一种普遍的机制,即任何端粒酶同系物在这个保守的位置上与酪氨酸区分糖(补充文件1,表1)。

讨论

端粒酶的催化循环和保真度

在本研究中,我们对单个核苷酸插入的TERT催化循环的每一步进行了表征。我们发现,就整体蛋白质结构而言,通过催化循环需要最小的重排。这种没有重排的情况与许多其他DNA聚合酶甚至HIV RT形成了对比,这些酶已经被证明在核苷酸结合时经历了从“开放”状态到“关闭”状态的整体转变(Doublié等,1999Sawaya等人,1994年施密特等人,2018年).虽然TERT催化核心不能打开和关闭的原因尚不清楚,但这可能是因为端粒酶功能所必需的其他复杂性限制了打开和关闭的发生,包括重复添加过程中的易位步骤或与其RNA组分的广泛相互作用。在活性位点内,我们观察到,在结合前,残基为进入的核苷酸提供了一个空腔,在结合后,残基进行调整以协调进入的核苷酸,并在新插入的碱基插入到产物状态后继续稳定其。许多参与催化循环的活性位点残基的位置与其他DNA聚合酶相似;一种由三个羧酸酯组成的三元结构,包含诸如D251、D343和D344的残基tcTERT在许多DNA聚合酶中是保守的(施泰茨,1999).有趣的是,R194和Q308的结构位置与人类DNA聚合酶η的R61和Q38相似,并且两者都在其催化循环中起重要作用(Biertümpfel等,2010).

动力学研究补充了我们的结构快照,使我们能够理解端粒酶是如何从错误的核苷酸中选择正确的;即选择碱基配对正确的标准dNTPs,而不是选择非标准rNTPs或碱基配对错误的标准dNTPs (图6A).我们的实验是使用一个4核苷酸悬挑RNA模板,通过单个dGTP插入进行的。虽然端粒酶显示出适度的碱基和位置特异性效应,但我们的结果表明,端粒酶催化核心一般表现出适度的碱基选择保真度,类似于参与DNA修复的x -家族聚合酶(陈等,2018麦卡洛克和昆克尔,2008年).根据我们的动力学值,我们预测端粒酶插入~ 1不匹配每10 kb端粒延伸。由于端粒酶没有校对区域,端粒酶产生的错误插入将在端粒伸长过程中保留为ssDNA。当互补链被DNA聚合酶复制时,错配的碱基(在端粒酶的情况下)将成为配对的碱基对,而不会成为错配修复的底物。因此,我们的保真度测量可以预测端粒序列中的细胞错误率。因此,我们预测的错误率与端粒测序观测到的端粒错误率一致(李等人,2018年)虽然我们还没有从生物学角度研究端粒错配的下游后果,但它们可能会破坏G-四联体的稳定性并抑制shelterin蛋白结合,因为这两种现象都依赖于DNA序列(图6BBurge等人,2006年2005年德兰格).

端粒酶如何保存端粒完整性和生物学意义的模型。

一个端粒酶催化循环,匹配的dNTP(绿色),不匹配的dNTPs(橙色),匹配的rNTPs(红色)。对于每个核苷酸路径,每一步都标记动力学参数和插入概率。(B端粒酶错配插入的下游结果可能包括错配修复的逃避,对庇护蛋白的结合亲和力降低,以及端粒G四链的稳定性改变。(C端粒酶插入rNTP的最终结果。在插入端粒后,核糖核苷酸可以通过水解或破坏端粒的封顶和稳定性造成严重后果。核糖核酸也可以通过核糖核酸切除修复去除。

端粒的核苷酸

DNA聚合酶在复制过程中,由于核苷酸浓度的巨大差异(细胞中rNTPs比dNTPs多50倍),会将数百万个rNTPs插入基因组(Traut 1994).端粒酶也必须针对这种差异进行选择;虽然端粒酶通常被认为只用dNTPs来延长端粒,但我们的动力学表明并非如此。相反,我们预测端粒每延伸10 kb,端粒酶就会插入约40个rNTPs,其选择性可与DNA聚合酶β和DNA聚合酶δ (布朗和索,2011年卡瓦诺等人,2010Nick McElhinny等人,2010年)然而,目前尚不清楚核糖核苷酸是否存在于端粒中,它们的生物学后果,以及它们是否与其他基因组核糖核苷酸类似,通过核糖核苷酸切除修复(RER)来解决(Sparks等人,2012年).在我们的人类端粒酶实验中,我们发现,即使在单个核苷酸插入水平上增加核糖核酸插入率,端粒伸长也会通过抑制易位步骤而降低(图5 e, F).即使端粒重复序列中存在一个rNTP,这种降低也是明显的。此外,先前的研究发现,包含核糖核苷酸的端粒底物可以阻止或减少第一个重复序列的扩展,这取决于DNA模板中核糖核苷酸的数量和位置(柯林斯和格莱德,1995年).端粒酶有可能在插入核糖核苷酸后暂停,从而为外部校对器或RER在端粒继续延伸之前移除核糖核苷酸提供机会。端粒酶以前曾被观察到在插入其他非典型核苷酸后终止端粒延伸,特别是在8-脱氧鸟嘌呤三磷酸(8-oxodGTP)插入的情况下(Fouquerel等人,2016年).因此,端粒酶可能在非典型核苷酸上停滞,如8-oxodGTP,出于类似的校对原因。

端粒酶对rNTP插入的鉴别是重要的,因为核糖核苷酸会导致端粒稳定性的多个下游问题。这些问题可能来自于端粒长度的直接减少和端粒结构的改变。由于RNA比DNA更容易水解,插入的核糖核苷酸更容易水解,这将导致端粒单链断裂(鲍曼和切赫,2001年2005年德兰格李和断路器,1999年).如果链断裂发生在端粒的互补链被复制并连接到基因组之前,伸长的单链将被释放,整个端粒伸长过程将需要重新开始(图6C).另一种情况是,插入的核糖核苷酸可能不会水解,而是留在端粒内。端粒中核糖核苷酸的持续存在可能会导致几种结构畸变,包括改变g -四重蛋白的稳定性和破坏屏蔽蛋白的结合(Fay等人,2017Nowotny等人,2005年)如果shelterin蛋白不能与端粒结合,端粒末端可能被认为是DNA损伤,激活双链断裂修复,并造成灾难性的生物学后果。

端粒核苷酸的细微改变已被证明会在细胞环境中引起端粒破坏(Fouquerel等人,2016年Mender et al., 2015Stefl等人,2001年).即使核苷酸中只有一个原子的改变,包括用硫取代鸟嘌呤中的一个氧形成治疗用的6-硫鸟嘌呤核苷酸,或将一个额外的氧加合到鸟嘌呤上形成8-氧鸟嘌呤核苷酸,都对端粒酶具有重要的生物学影响。因此,为了防止端粒破坏,端粒酶活性位点似乎已经进化出对非标准核苷酸的高度严格性,包括rNTPs和不匹配的dNTPs。这种严格性是明显的降低端粒延伸效率与每一种变体测试;其他突变也可以通过这个系统识别,显示端粒延长效率的增加。我们对端粒酶催化循环的结构表征使我们能够有效地修饰端粒酶的活性位点,生成易于插入rNTPs的人类端粒酶变体。这里显示的应用突出了将TERTs模型与互补的人类端粒酶研究相结合的潜力,以进一步探索端粒酶催化机制和筛选未来的端粒酶靶向治疗方法。

材料和方法

关键资源表
试剂类型
(物种)或
资源
指定 源或
参考
标识符 额外的
信息
基因(种有害castaneum tcTERT GenScript
基因((智人) hTR 汤姆凯奇博士的礼物
基因
(智人)
hTERT 汤姆凯奇博士的礼物
应变,应变背景(大肠杆菌) 一拍BL21(DE3)化学竞争力的底层大肠杆菌 表达载体 猫# C606010
应变,应变背景(大肠杆菌) 化学能力前十名大肠杆菌 表达载体 猫# C606010
细胞系(智人 hek293 T细胞,女性 ATCC. RRID:CVCL_0063 细胞是从ATCC获得的,并没有检测支原体,因为它们用于蛋白质生成而不是生物分析
转染构造(智人 pSUPER-hTR 汤姆凯奇博士的礼物 N/A
转染构造((智人) pVan107 3X标志hTERT 汤姆凯奇博士的礼物 N/A
DNA重组试剂 pET-28a (+)种有害Castaneum Tert. Genscript N/A
基于序列的试剂 端粒酶活性检测引物 踊跃参与 N/A 5 ' -GGTCAGGTCAGGTCA3 '
基于序列的试剂 RNA模板tc叔动力学 踊跃参与 N/A 5 ' -rCrUrGrArCrCrUrGACCUGACC3 '
基于序列的试剂 DNA引物tc叔动力学 踊跃参与 N/A 5 ' - / 6-FAM /CCAGCCAGGTCAG3 '
基于序列的试剂 RNA模板
对于tc叔crystallogarphy
踊跃参与 N/A 5 ' -rUrGrArCrCrUrGrArCrCrUrGrG
rCrUrGrG3 '
基于序列的试剂 DNA引物tc叔crystallogarphy 踊跃参与 N/A 5 ' -GGTTAGGGTTAGGGTTAG3 '
肽,重组蛋白 T4多核苷酸激酶 猫# M0201S
肽,重组蛋白 3 x标记肽 西格玛·奥尔德里奇 Cat#F4799-4MG
化合物、药物 2“-deoxyguanosine-5”——[(α,β)-methyleno]三磷酸(dGpCpp) 耶拿生物科学 猫#ν- 431
化合物、药物 γ−32 p ATP 优秀的 猫# BLU002Z250UC
化合物、药物 2-methyl-2, 4-pentanediol 汉普顿研究 第2-627类
软件、算法 傻瓜 埃姆斯利和考坦(2004年) https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ RRID:SCR_014222
软件、算法 凤凰 亚当斯等人,2010年 https://www.phenix-online.org/ RRID:SCR_014224
软件、算法 XDS Kabsch (2010) http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/ RRID:SCR_015652
软件、算法 MolProbity 陈等人(2010) http://molprobity.biochem.duke.edu/ RRID:SCR_014226
软件、算法 ImageJ 施耐德等,2012 https://imagej.nih.gov/ij/ RRID:SCR_003070
软件、算法 Kaleidagraph 协同软件 http://www.synergy.com/wordpress_650164087/kaleidagraph/ RRID:SCR_014980
软件、算法 ImageQuant TL v8.1 GE Healthcare Life Sciences http://www.g188bet体育电竞elifesciences。
com/en/us
RRID:SCR_014246
软件、算法 皮莫尔 薛定谔有限责任公司 https://pymol。
org/2/
RRID:SCR_000305
其他 大规模表达(LEX-48)生物反应器 附生植物 https://www.epiphyte3.com/LEX
其他 HisTrap HP 5毫升色谱柱 GE医疗保健生命科学 猫# 17524801
其他 POROS HS强阳离子交换树脂 热科学 猫# 1335906
其他 G-25旋转列 GE Healthcare Life Sciences 猫# 27532501
其他 Sephacryl 16/60 s - 200hr大小排阻色谱柱 GE Healthcare Life Sciences 第17116601类
其他 ANTI-FLAG M2亲和凝胶琼脂糖珠 西格玛·奥尔德里奇 猫# A2220

核酸序列

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为了生成TERT催化循环的晶体结构,所有的结晶实验都使用了以下DNA序列:5 ' - DNA引物GGTCAGGTCAGGTCA-3 '和RNA模板序列5 ' -rCrUrGrArCrCrUrGACCUGACC3”。在动力学研究中,我们使用了带有6-羧基荧光素(6-FAM) 5 '标记的DNA引物,以及5 ' -的DNA序列CCAGCCAGGTCAG3”。动力学反应中使用的RNA模板含有序列5'-rUrGrArCrCrUrGrArCrCrUrGrGrCrUrGrG-3 ',没有标记。在每种情况下,将寡核苷酸重悬在分子生物学级别的水中,并通过NanoDrop微体积分光光度计测量其在260 nm处的吸光度计算其浓度。用于晶体学的核酸底物按等摩尔比退火,但用于动力学研究的核酸底物按已标记引物与未标记引物的摩尔比1:2退火。我们使用热循环器对所有核酸底物进行退火,将其加热到90°C 2分钟,然后以0.1°C / s的速度冷却到4°C。

表达和纯化tc

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我们使用了以前发布的方法tcTERT的表达和纯化,但进行了一些修改(吉利斯等人,2008年).简单地说,我们成长tcTERT在bl21 (DE3)pLysS细胞中使用Epiphyte3 LEX生物反应器,在37°C,直到OD600为0.6-0.8,之后降温至30°C, 4-5小时的蛋白质生产。通过4000 x g离心收集细胞直至裂解。对于TERT纯化,我们在Ni-NTA色谱柱(GE Healthcare)上使用含有0.75 M KCl和10%甘油的缓冲液进行捕获步骤,然后在POROS HS色谱柱(Thermo Fisher)上使用0.5 M KCl到1.5 M KCl的盐梯度用阳离子交换进一步纯化我们的样品。然后,我们用烟草蚀刻病毒蛋白酶切六组氨酸标签,然后用Ni-NTA色谱柱纯化剪切标签。最后,我们使用稍微不同的缓冲液进行尺寸排除色谱(Sephacryl S-200 16/60, GE Helathcare),包含50 mM Tris- hcl, pH 7.5, 10%甘油,0.8 M KCl和1 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)。合成tcTERT浓缩至18 mg mL−1.在4°C下储存(吉利斯等人,2008年).

结晶的tc

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在结晶之前,我们进行了络合tc通过以蛋白质与DNA的1:1.2比例混合TERT及其核酸底物。为了增加蛋白质溶解性,我们在准备混合时加入520 mM KCltcTERT及其核酸底物。在含11%异丙醇、0.1 M KCl、25 mM MgCl的条件下,采用静滴气相扩散法生长二元复合晶体2, 50 mM卡可酯钠,pH 6.5。晶体生长的体积比优化为2.3µLtcTERT二元复合晶体+ 1.7µL的结晶条件,使共4µL。对于三元复合晶体,我们使用相同的条件,但包括0.69 mM dGpCpp (Jena Biosciences),下一个匹配序列中的传入核苷酸。最后,对于产物复合物,我们通过2.5 mM dGTP孵育形成一个长一个核苷酸的DNA链tcTERT及其核酸底物,使反应在22°C下发生30分钟,然后建立结晶滴。在所有情况下,在液氮中闪速冷却晶体之前,晶体被转移到含有80%贮液和20% 2-甲基-2,4-戊二醇(按体积计)的低温溶液中。

数据收集和优化

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所有数据集都是在波长为1.00 Å的地方收集的,使用的是欧内斯特·奥兰多·劳伦斯·伯克利国家实验室的先进光源的4.2.2同步加速器光束。使用XDS对数据集进行索引和缩放(RRID:SCR_015652) (Kabsch 2010Winn et al., 2011).最初的模型是使用PHENIX的分子置换(RRID:SCR_014224),使用以前发布的tcTERT结构,PDB编码3KYL (亚当斯等人,2010年米切尔等,2010年).在找到溶液后,所有的DNA和RNA碱基都建立在核苷酸前复合物中,然后生成的结构用于进一步的分子替换其他结构。模型构建是由Coot完成的(RRID:SCR_014222)和MolProbity验证(RRID:SCR_014226) (Chen et al., 2010埃姆斯利和考坦,2004年).对于≥3Å分辨率的结构,使用二级结构约束和来自核苷酸前二元结构的扭转约束来防止过度建模。所有的改进都是使用PHENIX完成的,数据是使用PyMOL生成的(RRID:SCR_000305薛定谔LLC)。对于每个结构,Ramachandran分析显示,至少100%的非甘氨酸残基占据了允许区域,至少93%的非甘氨酸残基占据了有利区域。

的稳态前动力学表征tc

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的前稳态动力学参数tcTERT是使用已建立的DNA聚合酶稳态前动力学协议,也称为单周转动力学(比尔德等人,2014年鲍尔斯和华盛顿,2017年).简单地说,我们预培养了2 μMtc200 nM退火的DNA:RNA杂交底物,DNA成分的5 '端有一个6-FAM标签。然后,我们使用KinTek RQF-3(一种快速急冷流仪)将感兴趣的入路三磷酸核苷酸与10 mM MgCl混合成等比2与现有的混合tcTERT及其DNA:RNA杂交底物。反应在37°C下进行,并在100 mM EDTA pH 7.5的不同时间点(10 ms至700 s)进行淬火。在每种情况下,用于每个反应的条件为:25 mM TRIS pH 7.5,0.05 mg mL−1.牛血清白蛋白,1毫米二硫苏糖醇,10%甘油,200毫米氯化钾,1 μMtcTERT, 100nm退火DNA:RNA杂交底物,和不同浓度的三磷酸核苷感兴趣。将样品转移到含有100 mM EDTA、80%去离子化甲酰胺、0.25 mg ml的DNA凝胶加载缓冲液中−1.溴酚蓝和0.25毫克毫升−1.二甲苯氰醇。为了生成最短时间点为12秒或更长的数据集,使用LabDoctor加热块代替KinTec RQF-3,并使用DNA凝胶加载缓冲液溶液完成淬火。然后将这些混合物在95°C下培养5分钟,并加载到21%变性聚丙烯酰胺凝胶上。这些凝胶在30°C、700 V、60 A和30 W下运行,以便将反应产物与其底物分离。

使用GE Typhoon FLA 9500成像仪对凝胶进行扫描和成像,并使用ImageJ (RRID:SCR_003070) (施耐德等,2012).从至少三个技术复制品中提取平均值和标准偏差,并使用KaleidaGraph(RRID:SCR_014980).随时间变化的产品形成曲线符合指数曲线方程1确定kobs价值观:

(1) P 一个 1 - E - K o B s T

[P]为产物浓度,A为目标啮合(振幅),t为反应时间。k后obs测定多个三磷酸核苷酸浓度的值,重新绘制数据以比较kobs三磷酸核苷的浓度,并适合方程2

(2) K o B s K P o L [ N T P ] K D + [ N T P ]

K波尔表示的理论最大值Kobs,和[NTP]代表感兴趣的核苷酸的浓度。

端粒酶表达

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HEK293T细胞分别在pSUPER-hTR和pVan107中过表达hTR和3 × FLAG标记的人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因。细胞在添加了10%高品质FBS (Hyclone)和1%青霉素-链霉素(Corning)的Dulbecco 's modified Eagle 's培养基(Gibco)中在37°C和5% CO2条件下生长至90%的融合度。用625 μl Opti-MEM (Gibco)稀释的pSUPER-hTR质粒10 μg和pVan107 hTERT质粒2.5 μg转染细胞,用25 μl Opti-MEM (ThermoFisher)稀释的Lipofectamine 2000 (ThermoFisher)质粒25 μl转染细胞。细胞转染后培养48小时,然后用磷酸盐缓冲盐水洗涤胰蛋白酶,并用CHAPS裂解缓冲液(10 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl)裂解2,1mM EDTA,0.5%CHAPA,10%甘油,5mMβ-巯基乙醇,120 u rnasin加(promega),1μg/ ml每种胃蛋白,抑肽酶,leapeptin和胰岛抑素,1mm aebsf)持续30分钟4°C。然后将细胞裂解物上清液冷冻并储存在-80℃。

端粒酶纯化

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端粒酶通过hTERT编码的pVan107上的3xFLAG标签纯化,使用ANTI-FLAG M2亲和凝胶琼脂糖珠(Sigma Aldrich),如前面描述的一些修改(Fouquerel等人,2016年).将80 μL的珠状浆液(每T75 flask)用10体积的1X人端粒酶缓冲液在30%甘油中洗涤3次,4℃、3500转/分、离心1分钟。将珠浆加入到裂解液中,在4°C下章动4 - 6小时。用1X人端粒酶缓冲液(含30%甘油)3次洗涤。端粒酶以250 μg/mL 3X FLAG peptide (Sigma Aldrich)的2倍体积在1X端粒酶缓冲液中以150 mM KCl洗脱。珠料浆在4°C下章动30分钟。用Mini Bio-Spin色谱柱(Bio-Rad)收集端粒酶。样品被快速冷冻并储存在−80°C。

32p末端标记DNA引物

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50 pmol PAGE纯化DNA引物GGTTAGGGTTAGGGTTAG(IDT)用γ-32P ATP(Perkin Elmer)标记为在20μL反应体积的1X PNK缓冲液(70mM Tris-HCl,pH 7.6,10mM MgCl2,5mM DTT)中用T4多核苷酸激酶(NEB)标记。将反应物在37℃温育1小时,然后在65℃下灭活20分钟。G-25旋转柱(GE Healthcare)用于纯化标记的底漆。

端粒酶活性测定

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端粒酶分析如前所述。反应包含1x人端粒酶缓冲液,5 nM的32p末端标记引物和50 μM dNTP或rNTP混合物,如图图例所示。每个反应有四个生物重复。反应是开始的3μL immunopurified端粒酶洗脱液,孵化在37°C指定的一段时间,然后用2μL终止0.5毫米的EDTA和热灭活20分钟的65°C。同等体积的加载缓冲区(94%,甲酰胺0.1×三羟甲基氨基甲烷borate-EDTA液(此种),0.1%溴酚蓝,从G-25旋转柱中提取的反应洗脱液中加入0.1%二甲苯氰)。样品在100°C下热变性10分钟,加载到14%变性丙烯酰胺凝胶(7M尿素,1 × TBE)上,在恒定的38W下电泳90分钟。使用台风磷光成像仪(GE Healthcare)对样本进行成像。使用ImageQuant定量引物扩展百分比(RRID:SCR_014246).

晶体数据

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我们的晶体结构的分辨率是用相关系数(CC)确定的1/2),具有包含CC的最高分辨率外壳1/2值大于0.3 (补充文件2表2)。在细化过程中,R工作和R免费的如诸如Phenix计算的,用于识别模型适合电子密度。看补充文件2,如表2a所示。

数据资源

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所报告型号的登录号为PDB: 6USO、6USP、6USQ和6USR。

参考

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  31. 31
  32. 32
  33. 33
  34. 34
  35. 35
  36. 36
  37. 37
  38. 38
  39. 39
  40. 40
  41. 41
  42. 42
  43. 43
  44. 44
  45. 45
  46. 46
  47. 47
  48. 48
  49. 49
  50. 50
  51. 51
  52. 52
  53. 53
  54. 54
  55. 55
  56. 56
  57. 57
  58. 58
  59. 59
  60. 60

决定信

  1. 玛丽亚间谍
    检查编辑器;美国爱荷华大学
  2. 辛西娅Wolberger
    高级编辑;美国约翰霍普金斯大学医学院

为了提高透明度,eLife会发布最实质性的修订请求以及相应的作者回复188bet体育电竞。

验收总结:

审稿人和审稿人都认为这项工作意义重大,因为端粒酶是如何从具有各种糖和碱基配对特性的核苷酸池中选择正确的核苷酸插入端粒重复序列的尚不清楚。这项工作是一个重要的进展,确定(至少在体外)端粒酶的核苷酸选择通过第一个高分辨率的晶体结构种有害castaneum端粒酶逆转录酶(TERT)在其整个催化循环中的作用以及Tribolium和人类TERT动力学的表征。作者用DNA/RNA双链与1个核苷酸(nt)的复合物解决了Tribolium TERT的三种结构与dGTP的不可水解类似物和产物DNA/RNA双链相同的双链。最重要的新发现是,存在一个空间门,允许TERT区分DNTP和RNTP。作者表明,该残基(Y717)在人类端粒酶中具有类似的功能。

同行评审后的决定书:

感谢您提交您的文章“端粒酶选择核苷酸的机制”,供188bet体育电竞.你的文章已经由三位同行审稿人审阅过了,评估工作由一位评论编辑和高级编辑辛西娅·沃尔伯格监督。审查人员选择匿名。

审稿人相互讨论了这些评论,审稿人起草了这个决定,以帮助您准备修改后的提交。

简介:

审稿人和审稿人都认为这项工作意义重大,因为端粒酶是如何从具有各种糖和碱基配对特性的核苷酸池中选择正确的核苷酸插入端粒重复序列的尚不清楚。这项工作是一个重要的进展,确定(至少在体外)端粒酶的核苷酸选择通过第一个高分辨率的晶体结构Triboliumcastaneum端粒酶逆转录酶(TERT)的整个催化循环和表征的Tribolium和人类TERT动力学。作者解决了Tribolium TERT的三种结构,包括一个带有1核苷酸(nt)悬垂的DNA/RNA双链复合物,一个带有dGTP非水解类似物的双链复合物和一个产物DNA/RNA双链复合物。最新颖的发现是一个空间门,它允许TERT区分dNTPs和rNTPs,作者表明,这个残基(Y717)在人类端粒酶中具有类似的功能。

然而,审稿人和审稿人认为,与其他结构和生化工作的讨论和比较不足,特别是鉴于这些新报道的结构与Gillis et al., 2008年和Mitchell et al., 2010年发表的结构之间的相似性,产品状态几乎与Mitchell等人2010年的报告相同。还有一个状态指定的问题需要通过实验来解决。

必要的修正:

需要新实验的重大修订:

审查员主要关注的是“状态I”的指定。作者选择了RNA引物只有一个3'核苷酸悬挑的底物,也许是为了防止后续的催化循环。但自tcTERT使用的RNA引物最多可悬吊6 nt,可以想象,模板-TERT构象,特别是RNA相互作用残基可能在1和6个模板碱基之间有很大的不同。在天然的端粒酶RNP中,RNA模板穿过TERT环。描述的评论家质疑“我”在报纸上只有1元过剩真正代表国家在最近的四膜虫EM I结构为4.8(科学江et al ., 2018),一段locked-DNA衬底的绑定到RNA模板,这可能是更具有代表性的国家我的周期。为了使本文的主要结论有效,作者需要提供一个I态的新结构和6 nt悬垂RNA引物(首选),或证明其结构与I态具有相同的行为方式。

其他重要的修正:

1) Wu et al., (EMBO 2017)广泛描述了DNA底物在每个重复合成周期中是如何处理的,并提出了一个比图1更详细的催化循环。它涉及到在合成物到达模板5'端之前的部分双工熔化,允许发生移位。研究还表明,每个端粒重复序列中每个nt的添加动力学并不相同(Chen et al., 2018)。到目前为止,在这项工作中只有一次dGTP的添加完成了结构和动力学,这将对重复的其他核苷酸有所不同。这一点需要谨慎处理。

2)作者鉴定了催化活性和保真度的关键残基,揭示了与其他DNA聚合酶的相似性和差异。也就是说,虽然Tribolium TERT为研究TERT结构提供了一个很好的模型系统,但它缺乏TEN结构域和很大一部分IFD,而这些结构域已被证明对人类和四膜虫的TERT活性和加工能力至关重要。这个主要的区别以及动力学观察是否可以推广到其他端粒酶值得讨论。

3) Y717空间门是区分dNTPs和rNTPs所必需的,这在人类端粒酶的例子中得到了很好的体现。重复序列中的核苷酸数量和合并率之间确实存在相关性。然而,有趣的是,这种酶仍然能够与rATP结合一对重复序列。这表明,在人类病例中,这种位置的rATP在一定程度上是可以耐受的。除了糖门,基地身份也会有影响吗?

4)对RNA周围关键残基以及传入核苷酸的描述往往过于模糊。需要更多的建模或描述。例如,R194如何在不同的州之间迁移?

5)请向不熟悉的人提供详细信息t . casteneum比如TERT和TR的分子量,以及它们与人类或小鼠端粒酶的区别。作者还应该对TR版本作更多的阐述t . casteneum.作为读者,我们假设作者不能与“tcTR”共结晶,原因类似于该领域不能结晶人类hTR + hTERT。请提供一些这方面的背景(可能在介绍中)。

6) 似乎作者在与DNA混合培养之前产生了RNA:DNA混合底物tc叔。原因是什么?他们可以孵育RNA 16-mertc让复合物组装起来然后加入15个分子的互补DNA底物?他们会看到同样的结果吗?从技术上讲,端粒酶的底物是DNA(核苷酸或单链)。RNA是酶复合物的一部分。

7)“产品复杂性”小节。有道理的是,有最小的重排,因为可以预测,大多数运动是在端粒酶的RNA亚基(在这个模型中缺失了)。然而,一个关键的问题是,在添加了完整的六聚体重复后,它是如何保持和易位的。作者可能想回顾最近的一篇论文(J. Biol。化学。,294(3.0):11579-11588, 2019). This work provides a more macro look at the telomerase catalytic cycle that may provide some insights into the present studies.

请详细说明化学步骤和核苷酸结合步骤。

9) “端粒酶的空间闸门”小节第三段。请包括使用的端粒酶的详细信息。是否使用3xFLAG标签和过度表达hTR的重组端粒酶?这一点很重要,因为我们现在已经看到用于端粒酶的标签在体外和体内活动中发挥作用。

10)图5C。如果您使用DNTPS和RNTPS生成定制的单链衬底,您甚至会失去第一次扩展吗?也许这样的实验将测试它“可能抑制端粒酶易位步骤”的假设。

11)分段“端粒酶的空间门”第四段。rGTP表现出最大的抑制。这是因为3g在六聚体重复中还是因为其他原因?对此进行一些讨论将会有帮助。

12)虽然所有的改变都导致端粒酶的端粒延长减少,但测试的任何改变是否增强了端粒延长(例如减少停顿,改善加工等)。这一点应该在讨论中提到。

13)当前一系列实验中是否有证据表明,插入的核糖核苷酸的改变会导致DNA损伤或缺乏庇护保护。虽然这已经被其他细胞显示使用改变核苷酸插入端粒,没有细胞研究在目前的研究证实或进展的猜测在讨论因为所有实验在目前研究使用人工体外(试管)方法。例如,改变的核糖核苷酸是否存在于端粒中,是否有证据表明RER去除了它们?另外,有什么证据表明每10kb一次错误插入会阻止防护林结合或破坏g -四重体的稳定性?即使有这些担忧,这些研究对帮助未来的研究证实和扩展这些发现很重要。

https://doi.org/10.7554/188bet体育电竞eLife.55438.sa1

作者回应

必要的修正:

需要新实验的重大修订:

审查人员的主要关切与“第一状态”有关命名。作者选择了一种RNA引物只有一个3'核苷酸悬垂的底物,可能是为了防止后续的催化循环。但由于tcTERT使用的RNA引物悬垂高达6个nt,可以想象模板TERT构象,特别是RNA相互作用残基在1和6 t之间可能会有很大的不同安置碱基。在天然端粒酶RNP中,RNA模板穿过TERT环。评审员质疑论文中描述的“状态I”是否真正代表状态I。在最近4.8Å的四膜纲EM结构中(Jiang et al.,Science 2018),一段被锁定的DNA底物与RNA模板结合,这可能更能代表循环中的状态I。为了使本文的主要结论有效,作者需要提供一种新的状态I结构,带有6 nt悬垂RNA引物(首选)或者显示它们的结构与状态I的行为方式相同。

首先,我们要就图1A,特别是我们的“状态I”命名法的混淆向审稿人和审稿编辑致歉。该图的生成非常简单,显然这是一个代表我们的混淆错误。为了解决此错误,我们采取了以下措施:(1)重新绘制图1A,对催化循环中的每个步骤使用不同的命名法;(2)制作了一个补充图(图1-图补充3),该补充图描述了端粒酶催化循环中一次端粒重复添加的所有18个步骤;以及(3)清楚地表明了我们在端粒酶催化循环中描述的每个结构的结构状态。下面对这些变化进行了扩展。

我们要感谢审稿人提出的附加结构的建议,并同意每一个悬臂长度从1到6将导致独特的TERT结构状态,总共需要18个结构。为此,我们花了一年多的时间积极筛选~7万种结晶条件。这包括筛选多个TERT蛋白构建物和40多种不同悬挑长度、发夹状和两侧有悬挑底物的不同核酸底物。此外,我们还利用了劳伦斯大学校园结构生物学核心的资源和专业知识来筛选额外的结晶条件和蛋白质结构,但无济于事。到目前为止,唯一成功获得结构信息的核酸底物是本文所述的核酸底物。即使在获得了最初的成功后,我们也花了几个月的时间来优化条件,并不得不在同步加速器x射线源上筛选数百个晶体,以获得这里展示的2.5 Å分辨率。因此,即使我们能够立即获得额外的新晶体击中,一个新的TERT结构可能需要一年以上的时间来产生一个可观的分辨率。值得一提的是,在实验室因COVID-19关闭之前,我们正在积极工作,以获得更多的高分辨率结构快照,以进行后续研究,一旦实验室和同步加速器重新开放,我们将继续这一工作,因为我们认为在端粒酶领域,每一步新颖的结构快照是一个紧迫的问题。

我们想强调的是,虽然我们的结构只有一个核苷酸缺口,而不是六个,但我们认为它为端粒酶的每一步催化循环提供了重要的见解。这是因为核苷酸前结合的类别被访问了6次(图1A和图1 -图补充3,步骤A1-6)在端粒酶易位步骤之前。换句话说,虽然模板RNA碱基在6个插入位置之间移动,但TERT活性位点必须经历一个一般的循环:游离核苷酸结合口袋→活性位点内结合核苷酸三磷酸→核苷酸插入(即产物形成)。在最初的提交中,我们试图根据TERT活性位点的成分对所有18种结构状态进行分组,但在这些同行评审的回应下,我们现在澄清了我们的催化循环,明确包括所有18种状态(见图1 -图补充3)。此外,我们已经改变了文本中的标记方案,现在将我们的结构快照标识为状态A6,B6,及6.在目前TERT的所有其他结构中(包括Mitchell et al., 2010, and Jiang et al., 2018), TERT活性位点位于引物末端,最后插入的核苷酸仍然在核苷酸结合口袋中,它们都是核苷酸加合的最终产物步骤的成员或图1 -图补3中结构状态的“C”类。我们认为这个新的标记方案强调了我们正在提出两种新的结构状态类别,“A”和“B”。此外,虽然A类和B类结构的结构信息未知(核苷酸前和三元),我们可以将我们的C类结构与低分辨率的cryo-EM结构进行比较四膜虫thermophila端粒酶(Jiang et al., 2018)关键活性位点氨基酸的位置tt叔状态C3.C项意为“与我们的国家紧密结盟”6(RMSD = 0.83,参见作者反应图1,图1 -图补充3的州指定)。这种不同状态和同系物之间的结构一致性意味着在所有6个悬垂长度中活性位点接触是相似的。

作者反应图1
ttTERT活性位点残基与tc叔。

重叠的tcTERT产品结构活性位点(状态C6,黄色)与活性位点来自ttTERT产品结构(状态C3,绿色,来自Jiang et al., 2018, PDB代码:6D6V)。包括催化残基(A)和核苷配位残基(B)在内的关键活性位点氨基酸残基排列紧密,均方根偏差(RMSD)为0.83。

最后,先前的动力学研究提供了证据,表明我们在本文中提出的结构状态比第一次插入事件的结构更能代表一个典型的端粒酶催化循环(我们在最初的提交中错误地称之为状态I)。在最近的一次EMBO论文(2018,Chen et al.),对所有六个模板位置进行稳态动力学。在本研究中,K根据注册表位置(即悬垂长度)的不同,传入核苷酸的值变化最大可达30倍。6-核苷酸悬垂值分别为120 μM, 4 -核苷酸悬垂值、2 -核苷酸悬垂值和单核苷酸悬垂值分别为4、31和5 μM。值得注意的是,在所有6个模板位置中,与其他5个位置相比,具有6个模板基底的基底表现出了动力学变化。因此,我们在这里报道的结构快照(一个核苷酸悬垂)很可能代表了一个典型的催化循环(即a的15/18结构态2到C.6与仅代表3/18结构态的六个核苷酸悬挑相比,图1 -图补充3)。

综上所述,对于我们最初提交的state I描述中的错误,我们深表歉意,并在修改稿中对此进行了更正。虽然我们希望得到一个具有6个核苷酸悬挑的结构,但我们不相信这能实现,可能需要对所有18个催化态进行后续研究。虽然无法获得这一结构信息,但与悬臂长度不同的TERT结构(作者反应图1)各种悬垂长度的动力学(在Chen等人,2018年进行)使我们确信,此处呈现的催化循环代表了端粒酶的典型催化循环。此外,我们在保真度、糖选择性和核苷酸结合亲和力方面描述的总体趋势是基于观察到的高达四个数量级的差异,并且可能不会因K的中度~30倍变化而改变在不同的注册表位置看到。

其他重要的修正:

1) Wu et al., (EMBO 2017)广泛描述了DNA底物在每个重复合成周期中是如何处理的,并提出了一个比图1更详细的催化循环。它涉及到在合成物到达模板5'端之前的部分双工熔化,允许发生移位。研究还表明,每个端粒重复序列中每个nt的添加动力学并不相同(Chen et al., 2018)。到目前为止,在这项工作中只有一次dGTP的添加完成了结构和动力学,这将对重复的其他核苷酸有所不同。这一点需要谨慎处理。

我们希望感谢审稿人,他们强调了催化循环的复杂性,以及进入的核苷酸的模板位置依赖性。关于这两种现象的进一步澄清已添加到手稿文本中,并在下面供参考。此外,手稿中的图1已经被仔细地更新,以更好地阐明和解决催化循环的细节。

“该核心催化循环重复六次,直至添加新的直接重复(图1A,状态C.6)添加一个端粒重复序列所需的所有18种端粒状态如所示图1— figure supplement 3 for reference. Importantly, as the telomerase approaches the end of its template, the DNA:RNA duplex at the 5’ end begins to melt, enabling telomerase to either (1) translocate and anneal the RNA component to the newly extended telomeric repeat, thus allowing for additional repeat addition; or (2) dissociate from the telomeric DNA.”

“我们的实验是使用一个4核苷酸悬挑RNA模板,通过单个dGTP插入进行的。虽然端粒酶已经显示出适度的碱基和位置特异性效应,但我们的结果表明,端粒酶催化核心一般表现出适度的碱基选择保真度,类似于参与DNA修复的X-family聚合酶(Chen et al., 2018;McCulloch和Kunkel, 2008)。

2)作者鉴定了催化活性和保真度的关键残基,揭示了与其他DNA聚合酶的相似性和差异。也就是说,虽然Tribolium TERT为研究TERT结构提供了一个很好的模型系统,但它缺乏TEN结构域和很大一部分IFD,而这些结构域已被证明对人类和四膜虫的TERT活性和加工能力至关重要。这个主要的区别以及动力学观察是否可以推广到其他端粒酶值得讨论。

我们小心地选择种有害castaneumTERT作为一个模型TERT,与hTERT相比,它缺乏TEN域和IFD的很大一部分。我们同意并希望感谢审稿人的建议,明确承认并讨论TERTs之间的这一重要差异。为了解决这个问题,我们创建了一个新的表,进一步说明了几个不同tert之间的差异,并添加了讨论这些关键差异的文本。

“尽管tert具有高度保守的活性位点,但在人类和人类之间的域结构有显著的变化tc叔。这些包括tcTERT缺少n端(TEN)域,并缺少部分插入的手指域(IFD)(补充文件1 -表1B)。这些结构域对于其他端粒酶同源物的活性是必不可少的,并且已经被推测对易位过程中端粒酶的棘轮尤为重要(Steczkiewicz et al., 2011)。因此,我们保持了我们的tc在单一周转(即插入)机制下的TERT动力学,并且,在可能的情况下,用人类端粒酶研究补充动力学结果,以描述端粒酶的催化循环。”

3) Y717空间门是区分dNTPs和rNTPs所必需的,这在人类端粒酶的例子中得到了很好的体现。重复序列中的核苷酸数量和合并率之间确实存在相关性。然而,有趣的是,这种酶仍然能够与rATP结合一对重复序列。这表明,在人类病例中,这种位置的rATP在一定程度上是可以耐受的。除了糖门,基地身份也会有影响吗?

我们感谢审稿人的评论,碱基同一性也可能在核糖核酸耐受性中发挥作用。我们最初认为端粒酶的作用主要取决于每个重复的插入数量,但也同意碱基的特性和模板中的位置也会影响端粒酶对核糖核酸的耐受性。这一点特别有趣,因为rATP在细胞中比其他核糖核苷酸的浓度高得多(Traut, 1994),所以插入更多rATP是有道理的,因此需要被耐受。这些想法已列入案文。

“在最极端的情况下,每个重复出现三个rNTPs,延伸产物明显进入第二次重复,而WT端粒酶几乎没有插入事件(图5E)。我们假设rGTP插入可以显著抑制WT端粒酶,因为在重复序列中的前两个插入是由rC模板化的。因此,第一个事件需要是rNTP插入,然后从可能不稳定的引物端插入另一个rNTP插入。我们无法解释抑制作用是由于每次重复的核糖核苷酸数量,还是序列依赖的抑制,还是两者的结合。与rGTP相比,当rATP存在时,端粒酶能够合并多个重复,尽管与dntp相比效率较低(图5E)。”

4)对RNA周围关键残基以及传入核苷酸的描述往往过于模糊。需要更多的建模或描述。例如,R194如何在不同的州之间迁移?

谢谢审稿人的评论。我们欢迎有机会进一步扩展我们的结构结果,并在整个章节中增加了更多的描述,包括R194的位置和环境在整个催化循环中如何变化。请查看结果部分的更改。

5)请给不熟悉casteneum端粒酶的朋友提供详细信息,如TERT和TR的分子量,以及它们与人类或小鼠端粒酶的区别。此外,作者还应详细阐述T. casteneum的TR版本。作为读者,我们假设作者不能与“tcTR”共结晶,原因类似于该领域不能结晶人类hTR + hTERT。请提供一些这方面的背景(可能在介绍中)。

我们感谢审稿人给我们机会进一步澄清TERT同系物之间的差异。由于端粒酶的TR组分在结构上创造了灵活性和异质性,审稿人正确地认为任何含有TR组分的端粒酶全酶都是结晶学的不良底物,这就是我们使用截短版本的原因为了解决这个问题(以及上面的第2点),我们创建了一个补充表(补充文件1-表1B),除了修改介绍性文本外,还包括不同物种的几个叔丁基之间的结构域和分子量的差异:

第三,使用删节版的栗树端粒酶RNA组分(TR),我们可以很容易地获得足够数量的分离、活性tcTERT用于通过预稳态动力学和x射线晶体学表征端粒酶催化循环(Gillis et al., 2008;阮等人,2018)。虽然TERTs具有高度保守的活性位点,但人类与TERTs之间的域结构发生了显著变化tc叔。这些包括tcTERT缺少Nterminal (TEN)域,并且缺少一部分插入的手指域(IFD)(补充文件1 -表1B)。这些结构域对于其他端粒酶同源物的活性是必不可少的,并且已经被推测对易位过程中端粒酶的棘轮尤为重要(Steczkiewicz et al., 2011)。因此,我们保持了我们的tc在单一周转(即插入)机制下的TERT动力学,并且,在可能的情况下,用人类端粒酶研究补充动力学结果,以描述端粒酶的催化循环。”

6)似乎作者在tcTERT孵育前就产生了RNA:DNA杂交底物。原因是什么?他们是否可以用tcTERT孵育RNA 16分子,使其能够组装,然后添加15分子互补DNA底物?他们会看到同样的结果吗?从技术上讲,端粒酶的底物是DNA(核苷酸或单链)。RNA是酶复合物的一部分。

感谢您对我们的TERT:RNA:DNA复合物生成的反馈。我们同意,在生物学背景下,端粒酶的RNA成分在与DNA结合之前作为酶复合物的一部分进行组装。因此,对于人类端粒酶实验,我们在进行任何人类端粒酶反应之前,将RNA组分与端粒酶组装在一起。在我们的结构研究中tc在加入TERT之前,我们预先培养了RNA和DNA因为同质样本对晶体的形成至关重要。我们假设,在加入DNA之前,将TERT与RNA成分混合,可能会导致过量的游离DNA链或一个不与DNA结合的TERT:RNA复合物,这可能会阻止晶体的形成。此外,当我们比较RNA链的位置从我们的结构,从最近的低温电子显微镜端粒酶全酶的结构(这是由酝酿叔:RNA与DNA链,江et al ., 2018) RNA链覆盖的位置之间的两个结构在酶的活性部位(作者反应图2).因此,我们并不预测改变组装顺序会对在结晶溶液中经过几天形成的TERT:RNA:DNA复合物的结构产生重大影响。

作者反应图2
RNA使用tcTERT结构vs TR from四膜虫thermophila

从我们的产品结构(黄色,状态C6)和最近的低温电镜结构的RNA成分的叠加t . thermophila(green, state C3, Jiang et al., 2018, PDB代码6d6v)。tcTERT蛋白显示为灰色条带供参考。

对于我们的前稳态动力学体系来说,最重要的是在引入核苷酸三磷酸之前,酶复合物完全组装好。这样,催化的限速步骤仅仅是核苷酸的结合和随后的酶转化;如果我们只孵化叔与RNA模板,然后启动反应通过添加DNA链和下一个传入的核苷酸,很可能在这一点上的速率限制步骤将退火两种核酸链而不是核苷酸绑定和随后的插入。因此,在这些分析中,我们还需要在开始反应之前对双相进行预培养。

7)“产品复杂性”小节。有道理的是,有最小的重排,因为可以预测,大多数运动是在端粒酶的RNA亚基(在这个模型中缺失了)。然而,一个关键的问题是,在添加了完整的六聚体重复后,它是如何保持和易位的。作者可能想回顾最近的一篇论文(J. Biol。化学。,294(3.0):11579-11588, 2019). This work provides a more macro look at the telomerase catalytic cycle that may provide some insights into the present studies.

感谢你引导我们关注这份最新的出版物;我们同意对催化循环的宏观观察与目前的研究相关,并在我们的催化循环介绍中注意到了本文的一些关键发现。当我们看到核糖核苷酸插入端粒酶失活时,一个悬而未决的问题是,失活机制是否与Sayed等人的研究中观察到的催化依赖失活有关。一种可能是iTAFs的再激活会增加非标准底物的易位效率。我们确实觉得这些问题,虽然很有趣,但不在目前手稿的范围之内。

“重要的是,当端粒酶接近其模板的末端时,位于5 '端的DNA:RNA双链开始熔化,使端粒酶既可以(1)转移和退火RNA成分到新扩展的端粒重复序列,从而允许额外的重复添加;或(2)从端粒DNA分离。一个端粒酶穿过这个催化循环的次数是受到严格控制的。最近的研究表明,端粒酶在两次重复后变得不活跃,但可以被最近发现的细胞内端粒酶激活因子(iTAFs)重新激活(Sayed等人,2019)。”

请详细说明化学步骤和核苷酸结合步骤。

我们已经在催化循环的背景下详细阐述了这两个步骤:

接下来,二元复合物结合进入的dNTP,并将正确的沃森-克里克碱基配对样本与RNA模板(图1A,状态B)1).这两个状态之间的转变代表了核苷酸结合的步骤,以解离常数(KD)。如果生成的三元复合物(TERT:DNA:dNTP)方向正确,TERT将催化磷酸二酯键的形成,并将端粒延长一个核苷酸(图1A,状态C)1).这两种状态之间的转变是化学步骤,其饱和核苷酸浓度的理论最大速率被描述为k波尔.在插入进来的核苷酸后,端粒酶将转移注册表,使活性位点与下一个模板碱基(形成状态A2).”

9) “端粒酶的空间闸门”小节第三段。请包括使用的端粒酶的详细信息。是否使用3xFLAG标签和过度表达hTR的重组端粒酶?这一点很重要,因为我们现在已经看到用于端粒酶的标签在体外和体内活动中发挥作用。

是的,所使用的端粒酶是带有3xFLAG标签和hTR过表达的重组端粒酶(见下文)。为了更清楚地了解所使用的构造,将方法的更多细节添加到Results部分:

“在这些检测中,将1.5个序列为TTAGGGTTAG的端粒重复序列与50µM的所有4个dNTPs或所有4个rNTPs孵育,并纯化3xFLAG标记的hTR过表达的人类端粒酶。”

10)图5C。如果您使用DNTPS和RNTPS生成定制的单链衬底,您甚至会失去第一次扩展吗?也许这样的实验将测试它“可能抑制端粒酶易位步骤”的假设。

端粒链中已存在的核糖核苷酸如何影响端粒酶的第一次延伸是一个特别有趣的问题。这种类型的问题是我们在之前的研究中对端粒插入的修饰核苷酸感兴趣的问题(Fouquerel et al., 2016)。在8- oxoguanine或8-oxodGTP的例子中,端粒链中存在的8-oxoG通过破坏阻止端粒酶结合的g -四链结构来增加端粒酶的活性,而端粒酶插入的8-oxodGTP则抑制了端粒酶的活性。这个例子强调了在退火寡聚物中插入的非典型核苷酸与已存在的修饰核苷酸的影响的复杂性。

为了回答这个问题,我们请审稿人参考一份研究端粒酶模板中核糖核苷酸影响的出版物(Collins和Greider,1995,EMBO).简单地说,端粒酶引物延伸试验使用的引物包含引物链中存在的不同数量的核糖核酸(见参考文献中的图6)。正如审稿人所预测的那样,在某些情况下,将核糖核苷酸置于引物链中甚至会抑制端粒酶的第一次延伸。在其他情况下,例如只有3个核糖核苷酸存在的寡核苷酸(序列:d(G3.T2G)2G3.r (U2G),端粒酶延长底物的效率降低。我们认为,从这些混合底物的见解,更好地提供了我们的解释核糖核酸如何影响端粒酶的机制。因此,我们增加了一个参考文献,以更好地说明我们的情况,核糖核酸抑制端粒酶易位:

“即使端粒重复中存在一个rNTP,这种减少也是明显的。此外,先前的研究发现,含有核糖核酸的端粒底物可以阻止或减少第一个重复序列的扩展,这取决于DNA模板中核糖核酸的数量和位置(Collins and Greider, 1995)。

11)分段“端粒酶的空间门”第四段。rGTP表现出最大的抑制。这是因为3g在六聚体重复中还是因为其他原因?对此进行一些讨论将会有帮助。

我们同意rGTP的存在在所有测试的单个核糖核酸中表现出最大的抑制作用。我们假设rGTP的抑制作用是由端粒序列中的因子引起的。因为在我们的实验设置中,第一个模板基是rC,所以第一个插入事件将是rGTP。在成功的情况下,序列中的下一个碱基也是一个rC,需要从潜在不稳定的引物末端延伸,然后再插入另一个rGTP。因此,端粒酶不能使端粒长度超过最初引物末端,这可能会限制其结合并使其与端粒末端结合(只有三个核苷酸碱基配对)。考虑到这一切,我们确实承认,鸟嘌呤的未知效应也可能发生,但我们无法在不改变端粒和TR序列的情况下测试这些效应,这将改变端粒酶的插入效率。我们确实认为这增加了讨论,并在手稿中对此进行了扩展:

“在最极端的情况下,每个重复出现三个rNTPs,延伸产物明显进入第二次重复,而WT端粒酶几乎没有插入事件(图5E)。我们假设rGTP插入可以显著抑制WT端粒酶,因为在重复序列中的前两个插入是由rC模板化的。因此,第一个事件需要是rNTP插入,然后从可能不稳定的引物端插入另一个rNTP插入。我们无法解释抑制作用是由于每次重复的核糖核苷酸数量,还是序列依赖的抑制,还是两者的结合。与rGTP相比,当rATP存在时,端粒酶能够合并多个重复,尽管与dntp相比效率较低(图5E)。”

12)虽然所有的改变都导致端粒酶的端粒延长减少,但测试的任何改变是否增强了端粒延长(例如减少停顿,改善加工等)。这一点应该在讨论中提到。

这项研究中的任何改变都没有增强端粒酶的延伸,这是我们在未来的研究中非常感兴趣的一种突变。我们在手稿中强调了这些结果:

“因此,为了防止端粒断裂,端粒酶活性位点似乎已经进化出了对非标准核苷酸的高度严格性,包括rNTPs和不匹配的dNTPs。这种严格性是明显的降低端粒延伸效率与每一种变体测试;该系统还可以识别出端粒延长效率增加的其他突变。”

13)当前一系列实验中是否有证据表明,插入的核糖核苷酸的改变会导致DNA损伤或缺乏庇护保护。虽然这已经被其他细胞显示使用改变核苷酸插入端粒,没有细胞研究在目前的研究证实或进展的猜测在讨论因为所有实验在目前研究使用人工体外(试管)方法。例如,改变的核糖核苷酸是否存在于端粒中,是否有证据表明RER去除了它们?另外,有什么证据表明每10kb一次错误插入会阻止防护林结合或破坏g -四重体的稳定性?即使有这些担忧,这些研究对帮助未来的研究证实和扩展这些发现很重要。

我们要感谢审稿人提出这些观点,并且我们同意核糖核苷酸和端粒链错配的稳态水平和生物学影响是当前研究提出的紧迫问题。因此,我们更明确地概述了当前研究带来的生物学问题我们已经在实验室建立了新的技术,包括细胞培养和改良端粒限制性片段分析来回答其中的一些问题,但它们目前还不清楚,我们认为超出了当前手稿的范围。

“据我们所知,虽然端粒错配的下游后果尚未在生物学背景下进行研究,但它们可能会破坏g -四重体的稳定性并抑制庇护蛋白结合,因为这两种现象都依赖于DNA序列(图6B) (Burge等人,2006;德兰格,2005)。”

[T]elomerase插入~40个rNTPs,其选择性与DNA聚合酶β和DNA聚合酶δ相当(Brown and Suo, 2011;卡瓦诺、比尔德和威尔逊,2010年;McElhinny et al., 2010)。然而,目前还不清楚核糖核苷酸是否会在端粒中持续存在,它们的生物学后果,以及它们是否会像其他基因组核糖核苷酸一样,通过核糖核苷酸切除修复(RER)来解决(Sparks et al., 2012)。

https://doi.org/10.7554/188bet体育电竞eLife.55438.sa2

文章和作者信息

作者详细信息

  1. 马修一个Schaich

    美国堪萨斯大学医学中心生物化学与分子生物学系
    贡献
    概念化,数据整理,形式分析,调查,写作-初稿,写作-审查和编辑
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
    兽人图标 "此ORCID iD标识本文作者:"0000-0001-6771-5623
  2. 萨曼莎·L·桑福德

    美国匹兹堡大学公共卫生研究生院环境和职业健康系,匹兹堡大学医学院希尔曼癌症中心
    贡献
    数据管理
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
  3. 格里芬一个韦尔夫

    美国堪萨斯大学医学中心生物化学与分子生物学系
    贡献
    数据管理
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
  4. 塞缪尔•约翰逊

    美国匹兹堡大学公共卫生研究生院环境和职业健康系,匹兹堡大学医学院希尔曼癌症中心
    贡献
    数据管理
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
  5. 星期四H Khoang

    美国堪萨斯大学医学中心生物化学与分子生物学系
    贡献
    数据管理
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
  6. 帕特里夏·L Opresko

    美国匹兹堡大学公共卫生研究生院环境和职业健康系,匹兹堡大学医学院希尔曼癌症中心
    贡献
    监督,写作-审查和编辑
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
  7. 布雷特·D戴夫

    1. 美国堪萨斯大学医学中心生物化学与分子生物学系
    2. 美国堪萨斯城堪萨斯大学医学中心癌症生物学系
    贡献
    构思,监督,资金获取,写作-初稿,写作-审查和编辑
    为对应
    bfreudenthal@kumc.edu
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
    兽人图标 "此ORCID iD标识本文作者:"0000-0003-1449-4710

基金

国家普通医学科学研究所(R35-ES030396)

  • 帕特里夏·L Opresko
  • 萨曼莎·L·桑福德
  • 塞缪尔•约翰逊

国家环境健康科学研究所(R35-GM128562)

  • 布雷特·D戴夫
  • 马修一个Schaich
  • 格里芬一个韦尔夫
  • 星期四H Khoang

堪萨斯大学(麦迪逊和莱拉自学研究生奖学金)

  • 马修一个Schaich

资助方没有参与研究设计、数据收集和解释,也没有决定是否将研究提交出版。

确认

我们感谢Jay Nix (Advanced Light Source分子生物学联盟4.2.2 beam)在远程数据收集和数据分析方面的帮助。根据合同DE-AC02-05CH11231,本研究使用了先进光源资源,该资源是能源部科学办公室的用户设施。我们感谢Amy Whitaker(堪萨斯大学医学中心)对手稿准备的有益讨论和帮助,感谢Scott Lovell(堪萨斯大学)对晶体优化的建议和帮助。这项研究得到了国家普通医学科学研究所[R35-GM128562 to BDF, MAS, GAW, THK]、国家环境健康科学研究所[R35-ES030396 to PLO, SLS, SAJ]、麦迪逊和莱拉自学研究生奖学金[to MAS]、美国国立卫生研究院临床和转化科学奖拨款(UL1 TR002366)授予堪萨斯大学医学中心。

高级编辑

  1. 辛西娅·沃尔伯格,约翰·霍普金斯大学医学院,美国

评论编辑

  1. 美国爱荷华大学玛丽亚间谍

出版的历史

  1. 收稿日期:2020年1月24日
  2. 录用日期:2020年5月18日
  3. 已发布记录的版本:2020年6月5日(版本1)

版权

©2020,Schaich等。

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    Jone Paesmans等人。
    研究文章

    Synaptojanin1 (Synj1)是一种磷酸肌苷磷酸酶,在突触前囊泡内吞过程中网格蛋白脱膜中起重要作用。它被确定为阿尔茨海默病、唐氏综合征和tbc1d24相关癫痫的潜在药物靶点,同时Synj1的功能缺失突变与癫痫和帕金森病相关。尽管它参与了一系列的紊乱,关于酶的结构和详细的机制信息是缺乏的。在这里,我们报道了Synj1的5-磷酸酶结构域的晶体结构。此外,我们还提出了该结构域与底物diC8-PI(3,4,5)P结合的结构3.,提供了活性位点被捕获底物的5-磷酸酶的第一张图像。结合对不同肌苷磷酸基团催化作用的分析,这些结构为Synj1机制提供了新的见解。最后,我们分析了三种临床错义突变(Y793C、R800C、Y849C)对催化作用的影响,揭示了synj1相关疾病的分子机制。

    1. 生物化学与化学生物学
    2. 结构生物学与分子生物物理学
    Inda Setyawati等人。
    研究文章

    能量耦合因子(ECF)转运体介导原核生物中微量营养素的输入。它们由一个完整的膜s组分(与底物结合)和ECF模块(通过ATP水解为运输提供动力)组成。有人提出,不同的s组分竞争对接到同一个ECF模块上,但缺乏一个最小的脂质体重组系统,需要证实这一想法。在这里,我们共同将叶酸(ECF- folt2)和泛酸盐(ECF- pant)转运蛋白重组为蛋白脂质体,并检测了主动转运过程中的串扰。输运动力学表明,s组分的交换是输运机理的一部分。竞争实验表明,衬底与FolT2的关联要比与PanT的关联慢得多。将ECF-PanT的晶体结构与之前确定的ECF-FolT2的结构进行比较,发现叶酸结合后的构像变化比泛酸盐更大,这可以解释动力学差异。我们的工作表明,由两个重组转运体组成的最小体外系统再现了在体内观察到的复杂动力学行为。