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刺痛反应的分子过滤器

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  5. 188bet app 是通讯作者
  1. 分子和细胞生物学,哈佛大学,美国系
  2. 生物系,布兰代斯大学,美国
研究论文
引用本文作为:188bet体育电竞eLife 2020; 9: e57578 DOI:10.7554/188bet体育电竞eLife.57578

抽象

所有的动物都能检测并整合不同的环境信号来调节行为。包括水母和海葵在内的蛇科动物,都是通过一种未知的触发机制,利用被称为线虫细胞的刺细胞来探测和捕捉猎物。这里,我们展示了Nematostella vectensis使用专用电压门控钙通道(nCa)V)来区分突出感官提示和控制炸药放电响应。在NCA改编V使异常敏感的电压依赖性失活,以抑制对非猎物信号的反应,如机械水湍流。猎物产生的化学感觉信号通过突触传递来急性缓解nCaV失活,使机械敏感触发掠食性攻击。这些发现揭示了刺胞动物刺痛反应的分子基础,并强调了单个蛋白质整合不同信号以引发离散动物行为的一般原则。

介绍

水母,海葵,和刺胞动物门使用水螅专门的细胞称为刺细胞,以促进双方的感觉和分泌所需的捕获猎物和防御(沃森和米尔·西博杜,1994年)。两种主要类型的刺细胞由新星海葵的触手(有助于捕捉猎物vectensis线虫,图1一个):(1)螺旋细胞,特定于珊瑚虫的细胞,它能挤出一个丝状的细胞器来诱捕猎物;(2)线虫细胞,泛细胞化细胞,它能喷射出一个单一使用的覆盖着毒液的倒刺来介导刺痛(Babonis和马丁,2017年)。来自猎物的感官信号作用于线虫细胞,以5.41×10的加速度触发一个特殊的细胞器(线虫囊)的爆炸性放电6g、 在所有生物过程中最快的(荷斯坦和塔恩特,1984年;Nüchter等人,2006年;图1 b). 线虫囊只能排出一次,因此蛰刺是一个能量昂贵的过程,可能受到严格的调控(沃森和米尔·西博杜,1994年,Babonis和马丁2014). 事实上,同时呈现的化学和机械(化学触觉)线索是引起线虫细胞放电所必需的(Pantin, 1942;沃森和Hessinger,1989年;沃森和Hessinger,1992年;安德森和布沙尔,2009年). 电刺激线虫细胞增加钙(Ca)释放的可能性2 +)-依附方式(安德森和麦凯,1987年;麦凯和安德森,1988年;桑托罗和萨里奥,1991年;Gitter等人,1994年;沃森和Hessinger,1994年a;安德森和布沙尔,2009年)但线虫细胞的直接记录是有限的,因此环境信号控制放电的机制没有得到很好的研究。

线虫细胞电压门控Ca2 +电流表现出灵敏的电压依赖性失活。

(一个)海葵(线虫)。比例尺=3 mm。(B)完整的(黄色)和排出nematocyte(蓝色)。比例尺=20μm以下。(C):从nematocyte和触手神经元代表膜片钳实验。比例尺=10μm以下。正确的:线虫细胞或神经元电压门控电流,由最大激活电压脉冲引起,在1s预脉冲至-110 mV(最大电流)、-90 mV(有色)或0 mV(失活,无电流)后。(D)Nematocyte电压门控电流在非常负电压灭活与神经元相比较。Nematocyte失活发生在电压更负比可以与在神经元中的S形失活关系相比,可以测定:nematocyte估计Vi1/2= -100.2±0.4mV, n = 13,神经元Vi1/2=-70.8±1.0mV,n=9。表观活化阈值相似(图1-图1A补充)。(E由-40毫伏和0毫伏脉冲引起)Nematocyte电压 - 门控电流的没有外部的Ca被废除2 +被镉(Cd)堵塞2 +)。n = 4表示0 Ca2 +三是乳糜泻2 +,P <0.001配对双尾Student t检验。(F)线虫细胞电压门控电流为Ca2 +-敏感。细胞外钙替代2 +,但不是Na+对于NMDG+,影响了逆转潜力。N = 3-4,P <0.001 5毫米的Ca2 +与其他条件相比,采用事后Tukey检验的单因素方差分析。(G)仅机械刺激时,线虫细胞释放量极少或缺失(n = 11, 3.3 mM Ca)2 +)。在有猎物提取物的情况下,机械诱发放电在细胞外Ca浓度和标准浓度上相似2 +(N = 8为3.3毫米的Ca2 +中,n = 5 10毫摩尔)和镉(Cd)阻断2 +(n=8)或去除细胞外钙2 +(n = 15)。在明胶涂覆的coverslips中嵌入已排出的线虫囊进行了定量。3.3 mM或10 mM Ca +猎物p<0.0012 +与其他条件,单向ANOVA与事后Bonferroni检验。数据表示为平均值±SEM。

在这里,我们证明了线虫细胞Nematostella vectensis使用专用Cav2.1电压门控钙通道正交仪(nCaV)整合不同感官刺激产生的动态电压信号。我们证明了线虫细胞本质上是机械敏感的,但nCaV表现出独特的电压依赖性失活,基本抑制细胞活动,从而防止对外来机械刺激的反应,如背景水湍流。我们进一步证明,感觉神经元与线虫细胞进行突触接触,神经递质乙酰胆碱(ACh)引起超极化反应,减轻nCaV失活,以允许随后的细胞刺激和化学 - 触觉诱发放电。因此,我们建议,国家版权局专门电压依赖性V作为感官辨别的分子过滤器。

结果

线虫细胞CaV渠道

我们首先从急性分离的线虫细胞中获得全细胞膜片钳记录,以研究线虫细胞信号转导。使用细胞内铯(Cs)+)阻断钾(K+电流显示一种电压门控的向内电流,这种电流被正的或去极化的膜电压激活(ICaV的,图1 c). 为了响应持续的正电压,电压激活的离子通道进入一种非导电的失活状态,并且在被负膜电压恢复到静止状态之前不能被激活。这种特性通常用于限制对重复或长时间刺激的反应,类似于受体脱敏。值得注意的是,我CaV的开始在电压更负灭活比我们在技术上测量,因此证明这个电导的不寻常电压灵敏度(图1 c, D)。为了确定这些特性是否只适用于线虫细胞,我们使用了带有荧光标记神经元的转基因海葵,以便于直接比较这些易激动的细胞类型(Nakanishi等人,2012年;图1 c)。神经元的电压门控电流有用于激活的下限阈值和显示出弱得多的电压依赖性失活(图1 c, D,图1位数的补充1A-d),类似于其他动物神经元中的电流(希尔,2001年)这表明线虫细胞具有不寻常的电压依赖性。离子替代和孔阻滞剂实验证实CaV的是Ca2 +-敏感电流(图1E,F),符合细胞外钙的贡献2 +化学感应放电(沃森和Hessinger,1994年a;Gitter等人,1994年;图1 g)。细胞外Ca浓度增加2 +不影响I的失活CaV的(图1,图1E补充),表明增强的电压依赖性失活是通道复合体固有的。这个观察很重要,因为它表明我CaV的使线虫细胞在典型的静息膜电压下完全失活,因此细胞不能从静息状态被刺激。

识别介导I的离子通道CaV的,我们产生了触手特异性转录和对齐从nematocyte富集细胞读取(Sunagar等,2018)。这个策略允许我们寻找可能编码Ca的差异表达的转录本V通道亚基(成孔α和β辅助和α2δ亚基)。的直系同源cacnb2,钙的aβ亚单位V通道,最高表达的CaV转录在nematocyte富集细胞,用水平14倍比海葵其它细胞更高(图2一个)。β亚基可以根据其剪接同种型,亚单位相互作用的调节以多种多样的方式电压依赖性和贩卖,和细胞背景(Buraei和Yang, 2010年)。重要的是,β亚基只有α亚基相互作用的高voltage-activated (HVA)钙通道(Perez-Reyes 2003)。同意健壮的β亚基的表达,我们发现重要的浓缩CACNA1A,HVA Ca的成孔亚基V2.1、高表达仙人掌2d1(图2 -图补充1A,B)。这些观察结果与先前的一份报告证实的具体表达一致CACNA1Anematocytes海葵的触手和表达的β亚基nematocytes从水母(Bouchard等人,2006年;Moran和扎孔2014;Bouchard和Anderson,2014年)。表达cacna1h,其不与辅助亚基相互作用(Buraei和Yang, 2010年),也被观察到,虽然在较低水平和所有细胞(图2 -图补充1A)。因此,仍然可能的是,在nematocytes电压门控电流不是由一个专门的Ca进行V亚型。

线虫属V表现出通过它的β亚基赋予独特电压依赖性的特性。

(一个)加州V通道复杂与α、β和α2δ子单元。电压门控钙(Ca) mRNA表达(转录本/百万,TPM)V)β亚基频道nematocyte-enriched细胞(蓝色)和non-enriched细胞(灰色)。n = 6, p<0.0001 for碳酸钙2.1在nematocytes与其他细胞,双向ANOVA与事后Bonferroni检验。(B)的异源表达的nCav通道(Nematostella CACNA1A,cacnb2,仙人掌2d1在非常负的电压下失活i1/2= -101.5±1.6mV, n = 5)与哺乳动物同源基因(mCa)的比较V,Vi1/2=-20.9±3.4mV,n=10)。表观活化阈值相同:nCaVVa1/2= -9.8±0.3mV, n = 5, mCaVVa1/2= -10.4±0.5mV, n = 9。在- 110 mV到- 10 mV的1 s预脉冲下测量失活,内扫描保持电位为- 90 mV。(CnCa)V表现出缓慢失活−70 mV控股潜力(0.2赫兹刺激,5 s inter-pulse间隔)是最适合的两个指数函数与时间常数10.0和369.5 n = 6,多个行双尾的学生的学习任务与意义p < 0.05 500年代由15 s和p < 0.0001。D) nCav在- 40mv时失活,在负持电位时迅速恢复。n = 7表示nCaV,对于mCa,n=6V。(E)从nCa记录的电压门控电流V或MCAV接着是- 110 mV预脉冲、- 50 mV预脉冲(彩色)和20 mV预脉冲。钙Vβ亚基在红色被取代的指示(哺乳动物β和Nematostellaβ蓝色)。比例尺=100帕,25毫秒(F)哺乳动物β位移nCaV电压依赖性失活到正电压。nCaVVi1/2= -73.2±1.2mV, n = 6。nCaV + mβ=−16.9±1.9 mV, n = 6。(G)半最大失活电压(Vi1/2)为钙V嵌合体。nCaV和nCa的p<0.0001V+ mβ,mCaV对mCaV+ nβ、单因子变异数分析与因果图基测试。在- 100 mV到10 mV的预脉冲下测量失活,内扫描保持电位为- 110 mV,以减少缓慢失活。数据以均数±sem表示。

不同的表达NematostellaV(nCaV:CACNA1A,cacnb2,和仙人掌2d1)产生的电压门控电流的表观激活阈值与Ca几乎相同V由各自的哺乳动物同源体(mCa)组成的复合体V,图2 b,图2-图补充1C,D)。两个通道有相似的激活动力学,但快速失活在nCa显着V,类似于本地ICaV的(图2 e,图2 -图补充1E)。重要的是,NCAV与mCa相比,电压依赖性失活大大增强V,而不管电荷载体(图2 b,图2 -图补图1F,G)。类似于我CaV的,nCaV显示出不寻常的敏感电压依赖性,并开始失活电压比我们可以测量与估计中点失活电压(Vi1/2)~ 80mv比mCa更负V(图2 b)。即使在-70毫伏,NCA保持电势V表现出缓慢的失活导致随着时间的推移对去极化刺激的反应急剧减少(图2 c). 这种缓慢的失活在很大程度上是通过将保持电位调整到-110mv来防止的,这表明当通道在接近或大于典型静息膜电位的电位处处于闭合状态时,失活就会发生(图2 -图补充1H)。重要的是,NCAV从失活恢复迅速,这表明通道可能是以下短暂暴露于负电压随后激活复位(图2 d)。这些独特的特性与本地I的独特属性非常匹配CaV的,建议nCaV形成了主要的钙V信道在nematocytes。

确定nCa的分子基础V失活,我们分析了嵌合钙VnCa中含有特定α、β和α2δ1亚基的配合物V或MCAVorthologues。使用控股−110 mV的潜力比较压敏失活,我们发现只有转移的β亚基显著影响压敏失活,而α或α2δ1子单元产生最小影响压敏电阻器激活,失活或动力学(图2 e,图2位数的补充1C-E)。事实上,其它β亚基可诱导的Ca HVA灭活显著超极化移V渠道(安田等人,2004)。在这种情况下,mCaVβ亚基大大nCa转移V正向失活约56mv,阻止完全失活,产生缓慢快速失活(图2E-G,图2 -图补充1E)。此外,nCaVβ为足以赋予大大提高电压依赖性失活到MCAV(图2E,G)。从这些结果,我们得出结论,nCaVβ,最丰富的CaV亚基nematocytes,赋予NCAV的唯一敏感电压依赖性失活。

线虫细胞兴奋性

因为电刺激与线虫细胞放电有关,有些线虫细胞能产生动作电位(安德森和麦凯,1987年;麦凯和安德森,1988年;安德森和布沙尔,2009年),我们使用电流钳记录线虫细胞对去极化刺激的电反应。在我们的条件下,线虫细胞的静息电位为- 64.8±8.9 mV,当注入静息电流(图3一)。我们进一步考虑了I的强电压依赖性失活CaV的可以防止兴奋。与此一致,当线虫细胞第一次被超极化到-90mV,然后被电流注入刺激时,我们观察到一个奇异的长电压尖峰(图3B,C). 相比之下,触手神经元在从相似的静息电压注入等效电流振幅时产生多个窄的尖峰,这与其他神经系统一致(图3A-C). 尖峰宽度和频率的差异似乎适合于介导不同的细胞功能:神经元中的动态信息处理和线虫细胞中的单一稳健放电事件。此外,这些结果表明,强电压依赖性失活阻止线虫细胞从静止状态激活。

线虫细胞的兴奋性需要超极化电压。

(一个)去极化电流注射只引起线虫细胞的第一次超极化,以解除失活。线虫细胞棘波振幅:静止时为0 mV,从-90 mV开始为41.5±2.2 mV。n=8,p<0.0001双尾配对学生t检验。与此相反,触须神经元从静止状态开始出现尖峰(31.5±1.7 mV,n=4)。(B)电流注射从线虫细胞中诱导出长而奇异的尖刺,从神经元中诱导出许多窄的尖刺。(C)线虫细胞和神经元的静息膜电位相似,但穗宽不同。n= 8个线虫细胞,n=4个神经元,p<0.01,双尾学生t检验。无论注射振幅(n = 8)如何,线虫细胞只产生一个峰值,而神经元则根据注射振幅(n = 4)产生不同的峰值频率。采用事后Bonferroni检验p<0.0001双向方差分析。数据以均数±sem表示。

K+通道有助于静息膜电压(估计线虫细胞K的逆转电位+是~-100毫伏),通常在电压尖峰后调节复极。因此,我们比较了K+线虫细胞和触角神经元中的电流,以了解穗宽可能是如何差异调节的。线虫细胞表现出短暂的外向钾+电流迅速失活,而神经元有大的持续K+电流,可能对复极化和重复尖峰现象很重要(图3 -图补充1A-C)。线虫细胞K的瞬时成分+电流对电压依赖性失活高度敏感,与ICaV的(图3-图补充1D)。K+电流通过快速细胞内Ca废除2 +螯合剂BAPTA或去除外部Ca2 +,类似于K的效果+渠道阻滞剂茶+(图3-图补充1E)。与这一观察结果一致,线虫细胞表达大量Ca2 +-活化钾+渠道(图3-图补充1F). 此外,使用细胞内Cs+阻止K+电流导致电压峰值延长,静息膜电压大幅升高,证实了K的作用+膜电压调节通道(图3-图补充1G). 我们建议+通道特性可能导致线虫细胞的单一宽峰值,而不是神经元的众多窄峰值。

线虫细胞感觉转导

如果线虫细胞由于I的独特电压依赖性失活而被基底抑制CaV的,它们是如何对感官信号作出反应,从而诱发放电的?线虫细胞放电需要同时检测化学和机械感觉线索(Pantin, 1942 b;沃森和Hessinger,1992年),即使机械刺激完整触角内的线虫细胞纤毛(cnidocil)本身可以诱导细胞去极化(Brinkmann et al., 1996;安德森和布沙尔,2009年). 事实上,我们发现分离的线虫细胞cnidocil的偏转引起一个机械门控内向电流,具有快速激活和失活动力学。这个电流被钆(Gd)消除3 +),阻断机械感受器和其他阳离子通道,而在神经元(图4A-C)。此外,线虫细胞富集细胞编码NompC(没有机械感受器电位C,图4-图补充1A),一种广泛保守的机械感受器,以前发现定位于水润(Schuler等人,2015年)。不同的表达NematostellaNompC (nNompC)导致了一种机械门控电流,其性质与天然线虫细胞相似,包括快速动力学和Gd3 +灵敏度 (图4A-C)。比较与果蝇正畸(dNompC)显示nNompC具有相似的快速动力学,Gd3 +敏感性、压力-响应关系和非选择性阳离子电导,都符合对机械敏感性和离子选择性(Jin et al., 2017;图4A-C,图4-图补充1B-D)。因此,我们得出的结论是,线虫细胞具有内在的机械敏感性,并提出nNompC有助于线虫细胞的机械敏感性。重要的是,这种机械引起的电流有足够的振幅,从非常负的膜电压引起一个尖峰,但不是从静息电压在ICaV的被灭活。

Nematocytes本质上是机械敏感性和间接化学敏感。

(一个)nematocytes的机械刺激引起的钆3 +-敏感的,瞬态向内的电流,具有类似于杂多表达的性质Nematostella(n)和果蝇(d)NompC通道。刺激阈值(吸移管位移):nematocyte = 1.7±0.3微米(N = 6),nNompC = 4.2±0.6微米(N = 4),dNompC = 4.2±0.5微米(N = 4)。未转染的细胞不相似刺激(N = 6)进行响应。(B)Gd阻断线虫细胞(n=6)、nNompC(n=4)和dNompC(n=4)的机械诱发电流3 +,而神经元的触手缺乏机械诱发电流(N = 8)。P <0.01双尾Student t检验。(C)线虫细胞(n=6)、nNompC(n=4)和dNompC(n=4)的机械诱发电流激活和脱敏动力学相似。(D)化学感受刺激没有直接影响nematocytes但神经递质乙酰胆碱(ACh中,n = 5)引起大的外向电流。n = 4的猎物提取物,NANA,谷氨酸,GABA,甘氨酸,P <0.001相对于乙酰胆碱等条件下,单向ANOVA与事后Tukey检验。(E在nematocytes乙酰胆碱诱发响应的)代表性电流 - 电压关系。(F)ACh激发性电流(N = 9)通过烟碱乙酰胆碱受体拮抗剂阻断物(筒箭毒碱= 4,美加明= 4)和一个相似的电流是由尼古丁(N = 4引起)。ACh激发外向电流通过A K抑制+通道阻断剂(TEA+, n = 4)和一个胞内Ca2 +螯合剂(BAPTA, n = 4),但不是蛋白信号拦截器GDPβS (n = 4)。p < 0.001车辆与拮抗剂,单向方差分析与因果图基测试。(G)在有或没有基质溶液的触须上进行乙酰胆碱酯酶染色(n = 3只动物为代表)。酒吧= 200μm规模。数据以均数±sem表示。

因为nematocyte放电是通过组合的化学和机械线索介导的(Pantin, 1942 b;沃森和Hessinger,1992年),我们想知道化学感应信号是否可以调节线虫细胞膜电压,以允许ICaV的激活和细胞反应。虽然猎物衍生的化学物质(<3kDa的盐水虾提取物)会引起强烈的行为反应,但类似的处理不会引起分离的线虫细胞的电反应(图4 d,图4-图补充1E). 考虑到体内细胞和放电活动需要同时受到机械刺激的猎物衍生化学物质的存在,化学接收可能通过功能耦合的细胞间接发生(普莱斯和安德森,2006年). 先前的研究表明线虫细胞和其他未知细胞类型之间存在突触联系(Westfall et al., 1998;Oliver等人,2008年)。为了测试这种可能性,我们对分离出的线虫细胞进行了筛选,以观察它们对保守性良好的神经递质的反应,结果发现只有乙酰胆碱(ACh)引起了显著的反应(图4 d, E)。ACh激发外向电流通过烟碱乙酰胆碱受体(nAChR的)拮抗剂废除由尼古丁概括(图4 f,图4-图补充1F). K+渠道阻滞剂茶+细胞内钙2 +螯合剂BAPTA抑制反应,提示乙酰胆碱引起ķ+的细胞内Ca提高下游通道活性2 +。尽管G蛋白信号传导抑制剂GDPβS没有影响外向电流,K的封锁+胞内Cs的电流+结果显示,细胞外Ca的增加增强了ach诱导的向内电流2 +和阻止由胆碱受体拮抗剂美卡拉明(图4 f,图4-图补充1G,H)。这些结果表明胆碱唤起了人们的Ca2 +-渗透性nAChR样信号通路与Ca结合2 +-活化钾+通道,与缺乏毒蕈碱乙酰胆碱受体一致Nematostella(Faltine Gonzalez和Layden,2019年)。与此观察一致,nematocyte富集的细胞表达众多胆碱受体样的成绩单其中有参与钙非常保守域2 +渗透性(富可丽,2004年;图4图1I,J)。最后,我们发现强大的乙酰胆碱酯酶活性的触角,进一步表明了乙酰胆碱在nematocyte功能信号作用(图4 g)。这些结果表明,线虫细胞利用胆碱能信号调节K+电流,类似于脊椎动物的毛细胞是如何传出的胆碱能神经支配调节胆碱受体-K+抑制听觉反应的通道信号(Elgoyhen和Katz,2012)。

为了确定蜂窝连接的起源nematocytes,我们使用的串行电子显微镜重建可视化nematocytes和相邻小区。我们分析了我们在靠近进行生理实验和容易地观察到的神经元和nematocytes类似触手组织(图5位数的补充1A,B)。在得到的显微照片,nematocytes进行了明确通过其独特的和丝囊cnidocil(标识图5 -图补充1C)。有趣的是,每一个表现出nematocyte一个漫长的过程目前未知功能的,即延伸到外胚层(图5 -图补充1D)。我们还观察到众多spirocytes,由一个大的细胞内螺纹状结构的存在(指示图5一个,图5 -图补充1C). 根据它们的突触接触和细胞外投射识别出推测的感觉神经元(图5一个,图5-图补充件1E,F). 重要的是,在每种线虫细胞和另一种细胞类型(感觉神经元或肺泡细胞)之间的连接处,致密的核心囊泡定位于电子致密区(图5一个,图5位数补充2A-E)。因此,线虫细胞接收来自神经元和肺细胞的突触输入,并可能作为整合多个信号的场所(图5 -图附录2F,G)。这一观察结果与刺胞动物同时释放多种细胞类型以最有效地捕获猎物的能力相一致(Pantin, 1942)。

线虫细胞的电压依赖性促进了刺痛所需的信号整合。

(一个):在以spirocyte和nematocyte之间的接合处的局部的电子致密区附近电镜观察示范致密核心囊泡。中间:左侧面板所示的线虫细胞和肺泡细胞的三维重建。这个盒子表示突触的位置。正确的:与假定的感觉神经元形成突触的不同线虫细胞的三维重建。方框表示突触的位置,如图所示图5 -图补充2C和E。(B) ACh诱导线虫细胞超极化。n = 6, p<0.01成对双尾学生t检验。(C)去极化电流注入不诱导从静止活性性质,但没有引发电压尖峰从最nematocytes超极化由乙酰胆碱。n = 6, p<0.01成对双尾学生t检验。(D)化学 - 触觉诱导nematocyte放电(触摸+猎物提取物中,n = 8)是由机械感受器电流阻断剂的Gd抑制3 +(n=7)和nAChR拮抗剂甲酰胺(n=14)。在没有化学刺激(触食提取物,n=5)的情况下,触食+ACh(n=14)足以诱导放电,而mecadalamine(n=12)则抑制放电。对照组与各治疗组比较p<0.0001,采用单因素方差分析和事后Bonferroni检验。数据表示为平均值±扫描电镜。

电压依赖性介导的信号整合

如何不同的机械感觉和化学感觉信号收敛引起放电?在与我们观察到胆碱受体激活增加ķ协议+通道活性,乙酰胆碱超极化线虫细胞的负电压,从中他们能够产生强大的电压尖峰(图5 b, C)。一些经过选择的静息电压为正的细胞仍然不能产生峰值,因此可以通过调节静息膜电压(图5位数的补充3A,B). 这些结果表明I的电压依赖性CaV的阻止对去极化信号的基础激活,如机械刺激,但激活nAChR使细胞超极化以减轻CaV的失活,从而放大去极化信号介导的细胞应答。

有两个到机械与化学感应输入的要求相一致,我们发现机械性刺激电流阻断剂钆3 +抑制化学触觉刺激放电。此外,nAChR拮抗剂mecadalamine大大降低了化学触觉诱导的放电(图5 d). 两种处理均能恢复线虫细胞的排泄能力(图5 -图补充3C)。此外,用于猎物衍生的化学品的要求通过乙酰胆碱(完全概括图5 d)。这些结果与化学感觉刺激下游乙酰胆碱信号的作用是一致的。因此,我们提出唯一的ICaV的电压依赖性失活提供了这样nematocytes过滤外来去极化机械信号的机构,但可以与去极化刺激整合在一起的化学感应诱导的超极化引起健壮信号放大和放电反应(图6)。

线虫细胞CaV属性过滤显著的化学触觉信号。

(一个)模型nematocyte信号集成。(B)Nematocyte CaV在休息被失活,从而不放大外来NompC介导的机械信号。通过乙酰胆碱的化学感应刺激超极化nematocytes信令对于Ca的解除失活V通道,然后可以放大机械刺激,使放电。

讨论

在这里,我们证明了nematocytes使用NCA的专业性V从环境噪声中滤除显著的化学触觉信号。Ca的参与2 +在这个过程中发出信号与Ca的既定角色是一致的2 +跨多种刺胞动物的媒介排泄内流(麦凯和安德森,1988年;桑托罗和萨里奥,1991年;沃森和Hessinger,1994年a)。然而,确切的机制,其中的Ca2 +流入调节排放尚不清楚。有人建议用Ca2 +内流改变线虫囊囊的渗透性和/或启动囊内离子的快速分解,从而引起细胞器内的渗透变化(卢博克和阿莫斯,1981年;拉伯克等人,1981年;韦伯,1990年;Tardent 1995)。我们的转录组分析表明,线虫细胞表达多种Ca2 +处理蛋白质(图5位数的补充3D-F),可以控制Ca2 +对空间限制性感觉传导级联反应的信号结构域。这个组织符合我CaV的受体介导的非选择性阳离子电导介导的扩增。事实上,钙V电流可介导的增加的> 500μM的Ca2 +考虑到在小的胞质体积(5%)上均匀分布,不被线虫囊所占据。未来的研究将为感官转导和器官生理学之间的耦合提供深入的理解。

我们的研究结果提出了一种机制,通过结合机械和化学线索来过滤重要的环境信息,并适当参与线虫细胞放电。然而,刺胞动物占据着独特的生态位,并可能进化出不同的生物物理特征来解释增加的动荡、特定的行为、或特定的猎物和掠食目标。无数的海葵占据着汹涌的潮汐池,而其他的,比如vectensis线虫,生活在平静的地区。同样,蛇床子科动物可以在不动期和自由漂浮期之间经历发育过渡,同时保持利用线虫细胞捕捉猎物的能力(马丁和Archer,1997年). 尽管与肉毒杆菌的物理接触相比,游动猎物产生的力可能可以忽略不计,但强烈的潮汐波可能足以引起机械感受性反应,从而干扰相关的化学触觉和随后的刺痛反应。这些生态差异可能需要不同的滤波机制来区分显著的猎物或捕食者信号。例如,珊瑚虫线虫细胞的解剖结构和对细胞和放电活性的药理学依赖性不同于水螅虫(安德森和麦凯,1987年;卡斯·西蒙和小斯卡帕蒂奇,2002年;Oliver等人,2008年). 事实上,线虫囊在形态上有很大的不同,不同的是挤压线的长度,刺的存在,以及毒素的组成(卡斯·西蒙和小斯卡帕蒂奇,2002年),可能反映的有机体的多样性需求。

突触连接所提供的模块性可以增加调控线虫细胞放电的信号多样性。例如,不同的化学受体细胞可以与特定的线虫细胞群形成突触连接,以介导离散的行为反应。除了化学混合物,如猎物提取物,许多氨基酸,脂类和N-乙酰化糖可以单独调节线虫细胞的排放(沃森和Hessinger,1992年)。虽然这些都是广泛分布的分子,但可能是不同的猎物或掠食者衍生的化合物调节特定的化学感觉细胞,分别与掠食性或防御性的线虫细胞(布雷斯,1990年)。事实上,我们观察到,无论是肺细胞还是神经元,都会与线虫细胞进行突触接触,从而在特定的刺激下释放乙酰胆碱。未来对化学感觉细胞和激活化学感觉细胞的生态相关化合物的鉴定和表征将为化学编码和突触信号机制的研究提供帮助。排放亦可受机体营养状况(桑德伯格等人,1971年)表明线虫细胞可以接受消化细胞或激素的输入。此外,各种类型的cnidocyte在cnidarian门中被发现,并受到与其行为目的相关的刺激的调节。例如,淡水蛇,普通水螅,使用特定的cnidocyte抓住表面进行趋光性,这表明这些细胞可以在感光细胞下游进行调节(Plachetzki等人,2012)。内anthozoans,nematocytes和spirocytes可用来控制放电相似或不同的机制。功能比较,就会发现特定的蛋白质,域或信号传导机制是否保守或在这些令人难以置信的专门的细胞类型的进化新奇引起(Babonis和马丁2014)。

从背景噪音中分辨行为相关刺激(如猎物)的能力尤其重要,因为线虫细胞是单一用途细胞,在放电后必须被替换。许多物种利用这些特殊的条件,通过适应逃避和利用线虫细胞放电为自己的防御目的。例如,小丑鱼可以生活在海葵的触须之间,没有任何有害影响,但这种情况发生的确切机制尚不清楚(卢博克市,1980)。海蛞蝓和栉水母的某些种类的猎物收购未获解除刺细胞,并将它们存储后防线,这表明这些生物能够在初始阻止放电反应(格林伍德,2009)。了解这种调控可以揭示细胞处理不同刺激的其他机制,并对这些种间关系的进化提供深入的了解。

材料和方法

关键资源表
试剂类型
(物种)或资源
任命 源或引用 标识符 额外
信息
应变,应变背景(vectensis线虫,(成人、男性及女性) Nematostella vectensis 伍兹霍尔MarineBiological实验室
应变,应变背景(vectensis线虫,转基因株系稳定,成株,雄株,雌株) NvElav1::莫兰格 (Nakanishi等人,2012年)
细胞系(智人) HEK293T型 ATCC CRL-3216
抗体 抗DsRed(兔多克隆) 豆类 猫#632496 1:50 0
DNA重组试剂 nCaV:cacna1a(质粒) 我们实验室的质粒(见材料和方法) Nematostella nCaVα
DNA重组试剂 nCaVcacna2d1(质粒) 来自我们实验室的质粒(见材料和方法) Nematostella nCaVα2δ
DNA重组试剂 nCaV:CACNB2(质粒) 来自我们实验室的质粒(见材料和方法) Nematostella nCaVβ
DNA重组试剂 nNompC(质粒) 来自我们实验室的质粒(见材料和方法) 线虫
DNA重组试剂 老鼠仙人掌2d1 (Lin等人,2004年) Addgene质粒# 26575 大鼠MCAVα2δ
DNA重组试剂 鼠标CACNA1A (Richards等人,2007年) Addgene质粒# 26578 小鼠大脑中动脉Vα
DNA重组试剂 老鼠碳酸钙2A (Wyatt等人,1998) Addgene质粒# 107424 大鼠MCAVβ
DNA重组试剂 dNompC-GFP YN扬(UCSF) 不适用 果蝇无公司
基于序列的试剂 滚道底漆 我们实验室生产的底漆(见材料和方法) PCR引物 GATTACGCCAAGTTATGCGTCCAATCTACTTGTCGGC公司
基于序列的试剂 滚道底漆 我们实验室生产的底漆(见材料和方法) PCR引物 加他加他加他加他加他加他加他加他加他加他加他
基于序列的试剂 Cacnb引物F 我们实验室生产的底漆(见材料和方法) PCR引物 CAGAGCCAGGCCTGAGCGAG
基于序列的试剂 Cacnb引物R 我们实验室生产的底漆(见材料和方法) PCR引物 GCCCCGTTAAAAGTCGAGAG
商用化验或试剂盒 智能赛车5'/3'套件 豆类 猫#634858
化合物,药物 N-乙酰神经氨酸(NANA) 适马 猫# 857459
化合物,药物 甘氨酸 适马 猫# 410225
化合物,药物 氯化乙酰胆碱 适马 猫#A6625
化合物,药物 GdCl3. 适马 7532类
化合物,药物 适马 猫#86614
化合物,药物 GDPβS 适马 猫# G7637
化合物,药物 CdCl2 适马 猫# 202908
化合物,药物 四甲双环庚胺 Tocris 猫# 2843
化合物,药物 谷氨酸 Tocris 猫#0218
化合物,药物 γ-Aminobutyric酸(GABA) Tocris 猫# 0344
化合物,药物 二酒石酸烟碱 Tocris 猫# 3546
化合物,药物 输卵管眼碱 Tocris 猫# 2820
化合物,药物 巴普塔 分子探针 猫# b - 1204
软件、算法 剪切适应 (马丁,2011) https://github.com/marcelm/cutadapt/
软件、算法 三位一体 (Grabherr等,2011) https://github.com/trinityrnaseq
软件、算法 InterProScan (Jones等人,2014年) https://github.com/ebi-pf-team/interproscan网站/
软件、算法 HMMER (艾迪,2009年) http://hmmer.org/
软件、算法 包含了 (EL-Gebali等人,2019) https://pfam.xfam.org/
软件、算法 钻石 (Buchfink等,2015) https://github.com/bbuchfink/diamond
软件、算法 欧米茄 (西弗斯等人,2011) https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/
软件、算法 斐济:与SIFT的线性堆栈对齐 (Schindelin等人,2012) https://fiji.sc/
软件、算法 Matlab自定义脚本 Matlab代码中提供的源数据图1 参见脚本的补充表
软件、算法 巨大的 (Berger等人,2018) https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/vast/
软件、算法 3D工作室Max 2019 (欧特克2019) https://www.autodesk.com

动物和细胞

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海葵(Nematostella vectensis)由马萨诸塞州伍兹霍尔海洋生物实验室提供,Nv-Elav1::mOrange转基因动物是F. Rentzsch赠送的礼物。我们用成年的雄性和雌性动物喂食刚孵化的盐水虾(卤虫),并在1/3的天然海水(新南威尔士州)中保持12小时亮/暗循环。从触须组织中分离出线虫细胞和神经元,麻醉动物在含(mM)的高镁溶液中获得:140nacl, 3.3 Glucose, 3.3 KCl, 3.3 HEPES, 40 MgCl2。细胞从触须到电生理学实验中分离之前立即通过用0.05%胰蛋白酶在32℃下,在二价自由记录溶液30分钟,并机械解离(毫米):140的NaCl,3.3葡萄糖,3.3 KCl,3.3 HEPES,pH值7.6。Basitrichous isorhiza nematocytes从触须分离和鉴定由包含带倒钩的螺纹的厚壁胶囊,具有特征性的高折射率,长方形形状和存在cnidocil的。Spirocytes通过含有薄,徒手螺纹,用于诱捕猎物薄壁胶囊鉴定。神经元被表达魔橙鉴定。

HEK293T细胞(ATCC,目录号CRL-3216,RRID:CVCL_0063,认证和验证为阴性的由供应商支原体)的DMEM中生长,10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素,在37℃,5%CO2. 根据制造商的方案,使用lipofectamine 2000(Invitrogen/Life Technologies)转染细胞。1微克Nematostella CACNA1A,碳酸钙2.1,仙人掌2d1m .骶(老鼠)CACNA1A,R家鼠(老鼠)碳酸钙2A,或者老鼠仙人掌2d1与0.5 coexpressedµg GFP。Mechanosensitive蛋白质化验使用与1µg HEK293T细胞转染果蝇NompC或Nematostella诺姆普。为了增强通道表达,实验前将细胞转染6-8小时,贴在盖玻片上,然后在28℃下孵育2-6天。果蝇NompC-GFP是YN jan Rat送的礼物仙人掌2d1(RRID:Addgene_26575),CACNA1A(RRID:Addgene_26578)是D.Lipscombe和碳酸钙2A(RRID:地址:107424)是海豚a的礼物。

分子生物学

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从成虫的触角中提取RNANematostella使用已公布的方法(Stefanik等人,2013年)。简言之,将50mg的触手组织的均化,使用TRIzol提取RNA。分离RNA并且DNA酶处理(ZYMO RESEARCH),然后用于cDNA文库合成(NEB E6560)。对于全长序列Nematostella用使用特异性引物(一个RACE策略获得钙通道β亚基GATTACGCCAAGTTATGCGTCCAATCTACTTGTCGGC公司加他加他加他加他加他加他加他加他加他加他加他)在扩增的触须组织库中。最终的序列使用与衍生序列末端相对应的引物(CAGAGCCAGGCCTGAGCGAGGCCCCGTTAAAAGTCGAGAG)从触手信使rna扩增全长cDNA,并对其进行测序以确定身份。nCav亚单位:cacna1a、cacna2d1、cacnb2和nNompC-GFP由Genscript(Piscataway,NJ)合成。序列比对是用欧米茄进行的。

转录组

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触手组织研磨成在液氮存在的细粉末在裂解缓冲液(50mM的Tris-HCl pH为7.5,250mM的氯化钾,35毫摩尔MgCl225毫米EGTA-KOH pH值8 5毫米德勤,小鼠核糖核酸酶抑制剂(内),1% (w / v) NP-40, 5% (w / v)蔗糖,100μg毫升−1放线菌酮(Sigma公司),500微克毫升−1肝素(σ))。裂解液在冰上孵育5 min,用18 g针头三次,4℃,16000 g离心5 min,除去不溶物。聚腺苷酸RNA被用来建立测序文库,并在Illumina HiSeq 4000 (Novogene)上进行测序。使用Cutadapt (马丁,2011),并使用Trinity重新组装了一个转录体(Grabherr等,2011)。使用InterProScan的(进行注释Jones等人,2014年)与黑豹成员数据库分析,HMMER (艾迪,2009年)与Pfam结构(EL-Gebali等人,2019)数据库,以及钻石(Buchfink等,2015)与所述的UniProt / TrEMBL中的数据库。

摘自已分类的cnidcells (Bioproject PRJNA391807Sunagar等,2018),对线虫细胞进行富集,得到如上所述的质量和适配器修剪,并使用Kallisto (Kallisto)对转录丰度(TPM)进行量化(布雷等人,2016年)和触手转录组。对于read映射可视化,使用Bowtie2 (Langmead和Salzberg,2012),输出文件则使用Samtools (Li等人,2009年),并使用集成的基因组学查看器进行可视化(罗宾逊等人,2011)。

电生理学

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记录均在使用MultiClamp 700B放大器(Axon Instruments)室温下进行,并使用Digidata 1550B(Axon仪器)接口和pClamp软件(Axon仪器)数字化。全细胞记录数据在1 kHz过滤并在10kHz取样。对于单通道记录,数据在2kHz过滤并在20kHz采样。数据值扣除泄漏值使用p / 4协议联机,和膜电位进行校正为液体接界电势。就全细胞nematocyte和神经元的录音,硼硅酸盐玻璃移液管进行抛光8-10MΩ。标准Nematostella以培养基为胞外液,含(mM):140nacl,3.3葡萄糖,3.3kcl,3.3hepes,0.5cacl20.5 MgCl2,pH值7.6。两个细胞内溶液用于记录。隔离向内电流(mM): 133.3 methanesulfonate铯,1.33 MgCl2,3.33 EGTA,3.33 HEPES,10蔗糖,10 CsEGTA,pH值7.6。对于外向电流(mM),166.67葡萄糖酸钾,3.33 HEPES,10蔗糖,1.33 MgCl2, 10凯格塔,pH . 7.6在一些实验中,用BAPTA取代了EGTA。在HEK293细胞全细胞记录,3 - 4 MΩ吸量管。细胞外标准溶液(单位:mM): 1400nacl, 5kcl, 10hepes, 2cacl2,1氯化镁2,pH值7.4。细胞内溶液(mM): 140 methanesulfonate铯,1 MgCl2,3.33 EGTA,3.33 HEPES,10蔗糖,pH值7.2。在离子取代实验中,等摩尔Ba2 +被替换为Ca2 +。单通道记录细胞外溶液含有(mM计):140的NaCl,10个HEPES,1 NaEGTA,pH 7.4中。所使用的细胞内溶液(mM计):140氯化铯,10个HEPES,1 CsEGTA,pH 7.4中。

使用了以下药物:N-乙酰神经氨酸(NaNaNa,100μM,Sigma)、甘氨酸(100μM,Sigma)、乙酰胆碱(1 mM)、甲淀粉酶(100μM,500μM用于行为实验,Tocris)、GdCl3.(100µMσ),谷氨酸(1毫米),GABA(1毫米),尼古丁(100µM Tocris),筒箭毒碱(10µM Tocris)茶+(10毫米,σ),BAPTA(10毫米,Tocris) GDPβS(σ1毫米),和Cd2 +(500微米,250微米用于行为实验)。全部溶解在水中。猎物提取物是从刚孵出的卤虫。卤虫瞬间冷冻,用研钵和研杵、过滤与0.22µM毛孔或3 kDa ultracentrifugal过滤器(Amicon UFC500324)。药理学效应被量化为同一细胞在应用药物浴后正常峰值电流的差异(I治疗/我控制)。全细胞记录被用来评估机械感觉和压电驱动(物理学Instrumente) fire-polished玻璃吸管(齿顶圆直径1μm)。机械步骤0.5μm增量应用每5 s,而细胞voltage-clamped−90 mV。通过高速压力钳系统(HSPC, ala - science)对单个机械敏感通道进行了研究。采用10毫米汞柱增量的压力步建立压力-响应关系。在施加重复的60mmhg压力脉冲时,以20mv的增量从- 100mv到100mv测量电流的电压依赖性。

除非另有说明,响应于在10个mV递增从-110毫伏电位保持一个200毫秒脉冲电压,测定电压 - 门控电流。G = I:G ^-V关系,通过计算得自I-V曲线得到CaV的/ (V- e),并符合玻尔兹曼方程。在- 10mv (Ca)期间测量了电压依赖性失活2 +在天然细胞电流),0毫伏(钙2 +异源通道中的电流),60 mV(K+在天然细胞电流)以下一系列1秒预脉冲范围从-110毫伏至60mV的电压脉冲。电压依赖性失活定量为I / I马克斯,和我马克斯发生在电压脉冲后的一个- 110 mV的预脉冲。在某些情况下,失活曲线不能用玻尔兹曼方程拟合,而是用指数拟合。电压依赖性失活的时间过程采用保持电压为- 110 mV或- 70 mV,每隔5秒施加0 mV测试脉冲来测量。失活后的恢复量是将失活和恢复的电流归一化,使之与施加- 110 mV电压脉冲的同一细胞所产生的电流相等。使用保持电压为- 40 mV的测试脉冲评估失活,然后使用- 110 mV的脉冲评估失活,此时电流很快恢复到最大振幅。使用从保持电压为−90 mV到−10 mV或0 mV的20ms脉冲进行重复刺激,也用于测量重复刺激时的失活。电流失活动力学是量化的部分电流剩余在一个200毫秒脉冲(R200)或适合一个单一的指数。激活被量化为从电流激活到峰值的时间。使用从- 120到100 mV的200 ms电压斜坡来测量ach引出的电流。刺激诱发的电流被归一化到基础电流测量在相同的电压80 mV。

在每个切除的patch记录中,从闭合和打开状态之间的噪声带中间测量单通道电流,或者从所有点的振幅直方图中得出闭合和打开峰值符合高斯关系的单通道电流。电导是根据I-V关系的线性斜率来计算的。N (PO)当电压保持在-80 mV时,在压力步骤中计算。在电流钳记录中,在无电流注入的情况下,测量乙酰胆碱或细胞内离子对静息膜电位的影响(I=0)。注入不同振幅的1s去极化电流步,测量以频率(峰值/秒)或宽度(峰值持续时间)量化的峰值。为了测试静息膜电位是否影响细胞产生尖峰的能力,注入超极化电流使细胞达到负电压(<-90mV),或在注入去极化电流前局部灌注乙酰胆碱。

Ca的变化2 +从nematocyte电压尖峰浓度估计基于Ca的积分2 +-0毫伏步进诱发的选择性线虫细胞电流与电压尖峰相同,持续时间略短。线虫细胞体积通过连续电镜重建估计,非线虫囊肿体积约占细胞总体积的5%。我们没有考虑其他细胞器所占的体积,这是一个保守的估计。此外,用含有0.5mm钙的细胞外记录液进行了计算2 +,大约比生理浓度低六倍。因此,我们计算的较大增幅可能低估了Ca总量2 +涌入。

免疫组化

神经染色

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成人Nv-Elav1::已有Nematostella在麻醉溶液中麻痹,然后放置在4%的PFA溶液中过夜。在两天内,用PBS中蔗糖浓度增加(10%至50%)的梯度对动物进行冷冻保护。低温恒温器切片(20μm厚)在室温下用0.2%Triton-X和4%正常山羊血清(NGS)渗透1小时,然后用DsRed多克隆抗体(Takara Bio Cat#632496,RRID:AB_10013483)在PBST(0.2%)和NGS(4%)中于4℃过夜。在第二次使用PBST(山羊抗兔647,Abcam在PBST+NGS中)之前用PBST冲洗组织三次,在室温下持续2小时。用PBS冲洗组织,用含有DAPI(Novus Biologicals)的Vectashield固定。

乙酰胆碱酯酶染色

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触须染色以确定是否存在如所述的乙酰胆碱酯酶(Paul等人,2010年),使用40μm厚的冷冻切片安装在载玻片上。载玻片在硫代乙酰和铜 - 缓冲溶液中在40℃温育直至触角呈白色。污渍用银溶液开发,使染色区域显示为棕色。载玻片在银染色溶液的存在下温育(+衬底)或盐水( - 底物)中,根据协议冲洗,并安装在Fluoromount-G(SouthernBiotech),并使用一个扫描,透射光显微镜成像。

行为

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根据已确立的化验方法(沃森和Hessinger,1994年a;Gitter等人,1994年)。成人Nematostella被放置在培养皿中含有一个修改过的Nematostella中,含16.6毫米氯化镁2。动物给予适当的时候,以适应新环境呈现刺激之前。用于测定放电5个毫米的圆形盖玻片包被25%明胶的溶液(重量/体积)溶解在介质中,并且允许固化过夜之前使用。盖玻片呈现给动物的触角为5秒,然后立即在20X放大率使用透射光源成像。为了测定到猎物衍生的化学品的行为反应,刚孵化卤虫是快速冷冻并粉碎,然后通过0.22μm过滤器过滤。盖玻片猎物提取物浸泡,并立即呈现给动物。所有的药理学试剂是浴施加,除了乙酰胆碱(1毫米),其之前立即向盖玻片呈现递送作为大丸剂。乙酰胆碱曝光没有产生触角的运动或收缩。实验在不存在外Ca的情况下进行2 +名义上钙2 +免费,不使用细胞外螯合剂。20倍镜下示出coverslip上最大密度的离体线虫细胞。线虫细胞放电涉及倒挂的带刺线,使他们嵌入涂胶的coverslips。因此,如果线虫细胞不放电,它们就不会被涂胶的coverslip捕获或可视化定量。使用自定义Matlab例程(可在补充材料中获得)对图像进行盲分析,对图像进行阈值处理,并在不同实验之间比较与线虫细胞相对应的像素分数。

电子显微镜

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个体的触须Nematostella vectensis被两个蓝宝石盖玻片之间相隔100μm间隔环(莱卡)在高压和冷冻冰箱(EM冰,徕卡)。随后在含1% ddH2O、1% OsO4和1%戊二醛的干丙酮中进行冷冻替代(EM AFS2, Leica),在- 90°C条件下冷冻48小时。升温至5℃/h至20℃,室温下纯丙酮3×10 min RT,环氧丙烷1×10 min,用1:1 Epon:环氧丙烷浸泡过夜,温度为4℃。随后将样品嵌入TAAB Epon (Marivac Canada Inc)中,在60°C条件下聚合48小时。超薄切片(约50纳米)在超微孔(Leica EM UC6)上被切割,并用自动磁带收集器(ATUM)收集卡斯特里等人,2015年)。然后将切片染色后的乙酸双氧铀和柠檬酸铅在成像之前与使用背散射电子探测器和4nm的像素尺寸的扫描电子显微镜(Zeiss SIGMA)。

扫描完所有切片后,使用斐济(Fiji)提供的算法“与SIFT进行线性堆栈对齐”(Linear stack Alignment with SIFT)将图像对齐到堆栈中(Schindelin等人,2012)。对准之后,图像被导入到VAST(Berger等人,2018)这样每个细胞都可以被手动追踪。通过检查切片和随后的细胞过程,识别并评估感兴趣细胞(如神经元和线虫细胞)之间的接触,以确定附近(~500nm)是否存在致密的核心囊泡。这样的例子被标记为假定的突触。然后使用3D Studio Max 2019(Autodesk,San Rafael,CA)在三维中渲染单元。

Nematocytes被容易地识别,因为树脂不会渗入胶囊丝囊,使得对于一个“空”外观(大的白色区域)。Spirocytes也容易鉴定基于包含长,卷绕长丝其胶囊。感觉神经元是按照较高数目致密核心囊泡,更高数量的突触的并延伸到所述外部环境的感觉过程的存在来鉴定。

统计分析

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数据用Clampfit(Axon仪器)或Prism(Graphpad)进行分析,并用平均值±s.e.m表示。n代表用于细胞/补丁或行为试验次数独立的实验。如果p <0.05使用成对或不成双尾Student t检验或单向或双向方差分析数据被认为是显著。所有的显着性检验是合理的考虑实验设计,我们假定正常分布和方差,如常见的是类似的实验。样本量基础上的统计显着性和技术可行性需要独立实验的号码来选择。

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    聚(-谷氨酸)是水螅线虫囊的主要成分。
    1. 韦伯
    (1990年)
    生物化学杂志 265:9664 - 9669。
  62. 62
  63. 63
  64. 64

决定书

  1. 罗纳德·卡拉布雷斯大号
    美国埃默里大学高级和评论编辑
  2. 哈罗德^ h扎孔
    美国德克萨斯大学奥斯汀分校评审员
  3. Sviatoslav N Bagriantsev
    评论家;耶鲁大学医学院,美国

为了提高透明度,eLife发布了最具实质性的修订请求和随附的作者回复188bet体育电竞。

验收总结:

这是一项对有趣的生物系统的优雅研究,线虫囊内藏有水母和海葵使用的刺状、注入毒液的鱼叉。该研究综合了细胞生物学、离子通道生物物理学、转录组学和神经行为学背景下的超微结构分析。特别有趣的是机械感觉和化学输入的相互作用,触发放电和一个不寻常的钙通道失活的作用和缓解这种失活的突触输入到线虫囊,触发长时间的动作电位和喷射线虫囊的鱼叉。

经同行评议后的决定函:

感谢您提交您的文章“cnidarian刺痛反应的分子过滤器”供考虑188bet体育电竞. 你的文章已经被三位同行评论员评阅过,而评论员也被罗纳德·卡拉布雷斯(Ronald Calabrese)作为资深评论员和评论编辑监督过。参与审查您提交的资料的下列人员同意透露其身份:Harold H Zakon(审查员1);Sviatoslav N Bagriantsev(审查员2)。

审稿人已经互相讨论了审稿人的意见,审稿人已经起草了这个决定来帮助您准备修改后的提交。

我们希望提请您注意我们针对COVID-19做出的修订政策的变化(//www.danecarr.com/articles/57162)。188bet体育电竞具体地说,我们要求编辑们立即接受他们认为可以接受的稿件,就像你的稿件一样188bet体育电竞无需额外的数据文件,即使他们觉得他们会手稿更强。因此,下面的修改只请求地址的清晰度和表现。

总结:

这是一个有趣的生物系统的优雅研究。虽然大多数人都知道水母会蜇他们的猎物(或粗心的游泳者),但大多数人都不知道有一种叫做线虫囊的复杂细胞,里面藏有水母和海葵用来刺人的、注入毒液的鱼叉。这项研究采用了细胞生物学、离子通道生物物理学、转录组学以及神经行为学背景下的超微结构分析等方法。此外,离子通道生物物理学的范围从钙和钙激活的K通道到机械感受器到神经递质感受器,呼吁各种通常不同的主题混合在一个全面的叙述。特别有趣的是机械感觉和化学输入的相互作用,触发放电和一个不寻常的钙通道失活的作用和缓解这种失活的突触输入到线虫囊,触发长时间的动作电位和喷射线虫囊的鱼叉。

必要的修正:

这篇论文以其全面性和创造性受到了评论家们的赞扬。有一些建议的修改,将使这篇强有力的论文包含在评论员的评论中。修订将由审查编辑处理,无需进一步审查。评审员3指出了一些进一步的试验;这些试验不需要继续进行,但如果已经完成,则可以包括在内。讨论应当承认,这些实验将进一步支持这些结论。如评论家2所建议,进一步扩大文章的篇幅,可以扩大该论文对一般读者的吸引力。

评论家# 1:

我只有一个问题。nCaV通道在正常静息电位范围内失活(对于这些细胞,-64 mV)。图1D显示nCav下面〜-80毫伏需要的膜电位恢复。在电压均在-110 mV的公司对因失活完全恢复钳分析的膜电位。我注意到,刺丝囊将移至-90 mV的膜电位秒杀,想必当搬到那里通过钙依赖性钾+当前。也许我错过了这一点,但什么是用于K反转电位+现在?除非它在~-80或更大的负反转,会有足够的超极化来消除nCa吗v失活吗?

评论家# 2:

我的主要考证是手稿写得很密。鉴于188bet体育电竞格式没有大小限制,我建议尽可能在文本中扩展实验细节。否则,该手稿将在很大程度上为电生理学家所了解,尽管其范围和兴趣远远超出了生物物理学领域。

图1F -如果我没记错的话,这里的作者要么在他们的标准溶液(Na)中记录,要么用NMDG代替胞外Na。但是从文本/图例中根本看不清楚。请澄清。

图1G和图5D -我正在努力理解为什么没有排出的线虫细胞的图像看起来没有任何东西,而我希望看到完整的线虫细胞,如图1B所示。同时,排出的图像看起来像完整的线虫细胞。请添加一些视觉指南/解释。

款“Nematocyte钙V“通道”和其他地方-“激活阈值”。我建议在整个过程中使用“明显的激活阈值”。

图2C,D。请指出曲线图上方的线是指在0毫伏电压下测试脉冲之间的5秒保持电压。如前所述,在没有阅读材料和方法部分的情况下做了什么是非常不清楚的。

评审人3:

1) 这些动物体内有压电1/2的同源物吗?如果是的话,作者可以测试一些激活剂和抑制剂。(作者不应致电Gd3 +“机械敏感受体阻滞剂”。这意味着特异性,但它阻断许多二价permeant离子通道)。

2)作者没有具体说明他们所说的“来自猎物的化学信号”或“来自猎物的提取物”是什么意思。他们应该更清楚地描述这些可能是什么,并在文本、材料和方法部分描述他们如何隔离它和测试什么。

3)目前还不清楚的ACh从spirocytes或神经元分泌的,以及是否EM显示出与任一含泡囊的结。如果乙酰胆碱释放的来源可能是确定的,这将增加一个重要的新点到纸张上。

https://doi.org/10.7554/188bet体育电竞eLife.57578.sa1

作者的反应

评论家# 1:

我只有一个问题。nCav通道在正常静息电位范围内失活(对于这些细胞,-64 mV)。图1D显示nCav下面〜-80毫伏需要的膜电位恢复。在电压均在-110 mV的公司对因失活完全恢复钳分析的膜电位。我注意到,刺丝囊将移至-90 mV的膜电位秒杀,想必当搬到那里通过钙依赖性钾+当前。也许我错过了这一点,但什么是用于K反转电位+现在?除非它在~-80或更大的负反转,会有足够的超极化来消除nCa吗v失活吗?

在我们的实验条件下,估计ķ+反转电位约为-100mV。这是负的静息膜电位,与K一致+-介导超极化解除nCaV失活。我们现在在文本中包含这个值。

评论家# 2:

我的主要考证是手稿写得很密。鉴于eLife format is not size-limiting, I'd suggest to expand on experimental details in the text whenever possible. Otherwise, the manuscript is going to be largely accessible to electrophysiologists, even though its scope and interest goes well beyond the biophysics community.

我们修改文本在几个方面来解释电生理检查结果,添加背景,和/或减少技术术语,这是在传说和在材料和方法部分中进一步描述。

图1F -如果我没记错的话,这里的作者要么在他们的标准溶液(Na)中记录,要么用NMDG代替胞外Na。但是从文本/图例中根本看不清楚。请澄清。

确实,Na的取代+和Ca2 +是为了确定哪个主要阳离子导致了ICaV的. 如前所述,不适用+与钙相比影响不大2 +. 为了清楚起见,我们修改了这个传说。

图1G和图5D -我正在努力理解为什么没有排出的线虫细胞的图像看起来没有任何东西,而我希望看到完整的线虫细胞,如图1B所示。同时,排出的图像看起来像完整的线虫细胞。请添加一些视觉指南/解释。

Nematocyte放电涉及外翻倒钩螺纹,导致它们嵌入在我们的测定用于检测排出nematocytes明胶涂覆的盖玻片上。如果nematocytes不放电,它们不会由明胶包被的盖玻片捕获或可视化的定量。排出的丝囊经常嵌入垂直于盖玻片表面,使得囊肿(大多数nematocyte细胞的,在外观上非常相似)是最明显的部件相对于排出的螺纹。我们已修改说明在图1中为了清楚起见,并加入进一步的解释的材料和方法部分。

款“Nematocyte钙V“通道”和其他地方-“激活阈值”。我建议在整个过程中使用“明显的激活阈值”。

“活化阈值”已全部更改为“表观活化阈值”。

图2C,D。请指出曲线图上方的线是指在0毫伏电压下测试脉冲之间的5秒保持电压。如前所述,在没有阅读材料和方法部分的情况下做了什么是非常不清楚的。

我们修改了传说为澄清有关的电压协议。

评审人3:

1) 这些动物体内有压电1/2的同源物吗?如果是的话,作者可以测试一些激活剂和抑制剂。(作者不应致电Gd3 +“机械敏感受体阻滞剂”。这意味着特异性,但它阻断许多二价permeant离子通道)。

有可能Nematostella vectensis表达压电1/2通道,但我们没有检测到丰富的同源转录物,也不清楚这些非特异性通道是否存在特异性激动剂或拮抗剂。我们的数据支持,NompC可能有助于线虫细胞的机械传递,但我们承认,其他描述或未描述的机械感受器可能涉及。因此,我们传递了一种关于线虫细胞机械感受器的分子鉴定的假想语气,并强调我们的主要结论是内在细胞机械感受性。我们添加了文本来指定Gd3 +还阻断其他的阳离子通道。

2)作者没有具体说明他们所说的“来自猎物的化学信号”或“来自猎物的提取物”是什么意思。他们应该更清楚地描述这些可能是什么,并在文本、材料和方法部分描述他们如何隔离它和测试什么。

我们进一步指定了分离猎物提取物的方法,并讨论了潜在的活性分子。我们完全同意,化学感觉细胞的鉴定将是进一步了解感觉统合、化学编码和突触调节的未来方向。我们现在在讨论部分进一步讨论这个问题。

3)目前还不清楚的ACh从spirocytes或神经元分泌的,以及是否EM显示出与任一含泡囊的结。如果乙酰胆碱释放的来源可能是确定的,这将增加一个重要的新点到纸张上。

如上所述,我们一致认为,鉴定化学感觉细胞和调节线虫细胞的传送器的来源将是一个极好的未来方向。我们在讨论部分对此进行了扩展。

https://doi.org/10.7554/188bet体育电竞eLife.57578.sa2

文章和作者信息

作者详细信息

  1. Keiko堰

    美国剑桥哈佛大学分子与细胞生物学系
    贡献
    概念化,数据收藏,正式的分析,调查,方法,写作 - 原草案,写作 - 审查和编辑
    相互竞争的利益
    没有利益冲突的声明
    兽人图标 “这ORCID ID标识这篇文章的作者:”0000-0002-2501-9352
  2. 克里斯托弗杜普雷

    美国剑桥哈佛大学分子与细胞生物学系
    贡献
    数据收藏,正式的分析,方法论,写作 - 审查和编辑
    相互竞争的利益
    没有利益冲突的声明
    兽人图标 “这ORCID ID标识这篇文章的作者:”0000-0002-5929-8492
  3. 莉娜van Giesen

    美国剑桥哈佛大学分子与细胞生物学系
    贡献
    正式的分析,写作 - 审查和编辑
    相互竞争的利益
    没有利益冲突的声明
  4. 艾米S-Y李

    美国威豪市布兰代斯大学生物系
    贡献
    数据收藏,正式的分析,写作 - 审查和编辑
    相互竞争的利益
    没有利益冲突的声明
    兽人图标 “这ORCID ID标识这篇文章的作者:”0000-0002-4121-0720
  5. 尼古拉斯·贝罗诺

    美国剑桥哈佛大学分子与细胞生物学系
    贡献
    概念化,数据收藏,正式的分析,监督资金收购,调查,方法,写作 - 原草案,项目管理,写作 - 审查和编辑
    为对应
    nbellono@harvard.edu
    相互竞争的利益
    没有利益冲突的声明
    兽人图标 “这ORCID ID标识这篇文章的作者:”0000-0002-0829-9436

资金

纽约干细胞基金会(罗伯逊神经科学研究员)

  • 尼古拉斯·贝罗诺

芝加哥社区信托(塞尔学者计划)

  • 尼古拉斯·贝罗诺

Esther A.和Joseph Klingenstein基金(Klingenstein- simons Fellowship)

  • 尼古拉斯·贝罗诺

国立卫生研究院(R00DK115879)

  • 尼古拉斯·贝罗诺

国立卫生研究院(1F31NS117055)

  • Keiko堰

瑞士国家科学基金会(P2SKP3-187684)

  • 克里斯托弗杜普雷

美国国立卫生研究院(P2SKP3_187684)

  • 克里斯托弗杜普雷

瑞士国家科学基金会(P400PB-180894)

  • 莉娜van Giesen

斯隆基金会

  • 尼古拉斯·贝罗诺

芝加哥社区信托(塞尔学者计划)

  • 艾米S-Y李

资助者没有参与研究设计、数据收集和解释,也没有决定将作品提交出版。

致谢

我们感谢J Lichtman和F Engert有用的建议在这项研究中,B Bean, D朱利叶斯,和R Nicoll的批判阅读手稿,K Boit援助和电镜分析,与免疫组织化学J Turecek求助,K与海葵Koenig求助。这项研究受到了赠款从纽约NWB干细胞基础上,西尔学者计划,阿尔弗雷德P斯隆基金会Klingenstein-Simons奖学金,和美国国立卫生研究院(R00DK115879),以及美国国立卫生研究院(1 f31ns117055)千瓦,瑞士国家科学基金会(p2skp3 - 187684) CD和举债经营(p400pb - 180894) LVG Lichtman和NIH (U24NS109102) J。

高级和编辑审查

  1. 罗纳德·卡拉布里亚,埃默里大学,美国

评论家

  1. 哈罗德^ h扎孔,德克萨斯大学奥斯汀分校,美国
  2. Sviatoslav N Bagriantsev,耶鲁大学医学院,美国

出版物历史

  1. 收稿日期:2020年4月4日
  2. 接受日期:2020年5月9日
  3. 发布的记录版本:188bet app

版权

©2020,Weir等。

这篇文章是根据知识共享署名许可协议,允许无限制地使用和再分配提供的原始作者和源记。

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