1. 植物生物学
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改变了的N-聚糖组成影响鞭毛介导的粘附衣藻reinhardtii

  1. 小南南徐
  2. 安妮·奥尔特曼斯
  3. 龙胜赵
  4. 安东尼Girot
  5. 马尔基·卡里
  6. 劳拉Hoepfner
  7. 西蒙Kelterborn
  8. 马丁朔尔茨
  9. 茱莉亚贝ß厄尔
  10. 彼得·赫格曼
  11. 奥利弗Baumchen
  12. Lu-Ning刘
  13. Kaiyao黄 是通讯作者
  14. 迈克尔hipple说道 是通讯作者
  1. 中国科学院水生生物研究所,中国科学院藻类生物学重点实验室
  2. 中国科学院大学,中国
  3. 德国米恩斯特大学植物生物学与生物技术研究所
  4. 英国利物浦大学综合生物学研究所
  5. 山东大学微生物技术国家重点实验室,海洋生物技术研究中心
  6. 马普动力学和自组织研究所(MPIDS),德国
  7. 德国柏林洪堡大学实验生物物理生物学研究所
  8. 德国拜罗伊特大学实验物理V
  9. 中国海洋大学海洋生命科学学院,深海多圈层与地球系统前沿科学中心
  10. 日本冈山大学植物科学与资源研究所
研究文章
引用这篇文章作为:188bet体育电竞eLife 2020; 9: e58805 doi:10.7554 188bet体育电竞/ eLife.58805

摘要

单细胞藻类衣藻reinhardtii,存在N两鞭毛表面的-糖基化蛋白对交配过程中细胞间的相互作用和鞭毛表面的粘附都至关重要。然而,我们不知道的是它的存在还是它的组成N-聚糖连接到各自的蛋白质是重要的这些过程。为此,我们测试了几个c . reinhardtii木糖基转移酶1A的插入突变体和一个CRISPR/Cas9敲除突变体,均具有改变N多糖的组成部分。利用原子力显微镜和微吸管力测量,我们的数据显示,n -聚糖复杂性的降低阻碍了鞭毛与表面结合所需的粘附力。这导致聚苯乙烯珠结合和运输受损,但细胞在固体表面不能滑动。值得注意的是,组装、鞭毛内运输和蛋白质进入鞭毛不受改变的影响N糖基化。因此,我们得出适当的结论N鞭毛蛋白的-糖基化对粘附至关重要c . reinhardtii细胞在表面,表明N-聚糖通过表面直接接触介导表面粘附。

介绍

N-糖基化是翻译后的主要修饰之一,主要发生在ER/高尔基体分泌途径N-连接聚糖在面向细胞外空间的蛋白质上被发现。最初的步骤N-糖基化在大多数真核生物中是高度保守的,包括一个共同的预构建的合成N磷酸二醇上的糖前体。随着糖前体转移到一个新生蛋白的共识序列N-X-S/T的天冬酰胺上(X可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸),糖蛋白被糖折叠,识别伴侣Calnexin和Calreticulin (斯坦利和谷口,2017).后续N-糖的成熟步骤在高尔基是依赖于物种,并产生大量的N多糖的结构。在陆生植物中,高尔基体的成熟导致Nβ1,2-核心木糖和α1,3-核心焦点修饰的-聚糖(《2016年).在衣藻reinhardtii,一种单细胞双鞭毛虫绿藻,N-聚糖可以用核心木糖和-聚焦(卢卡斯等人,2020年奥尔特曼斯等人,2019年Schulze et al., 2018).此外,6 o-甲基化甘露糖和添加末端连接的β1,4-木糖(matthew - riveet et al., 2013).而功能优势N-连接聚糖与成熟蛋白质的关系尚不清楚,但已知的是阻断完整的N-聚糖前体导致低糖基化的蛋白质不能正常折叠(Gardner et al., 2013).相反,它们通过er相关降解途径(ERAD)降解,因此不能正确定位(亚当斯等人,2019年Cherepanova等人,2016年).因此,在单细胞和多细胞生物中,早期的糖基化损伤都是致命的,只有谨慎地给糖基化抑制剂量时(例如通过衣霉素),可以观察到低糖基化引起的即时生理效应(Kukuruzinska等人,1987年).看着c . reinhardtii,囊霉素对营养细胞的治疗导致鞭毛黏附性受损,表明糖蛋白对黏附和随后的滑动起着至关重要的作用(Bloodgood等人,1987年).然而,这种表型是否与低糖基化和/或缺乏导致的蛋白质靶向错误有关N鞭毛表面的-聚糖尚不清楚。

全细胞滑行是两种基于鞭毛的运动之一c . reinhardtii除了游泳(石川和马歇尔,2011年Kozminski等人,1993Snell等人,2004年).原则上,细胞通过鞭毛附着在一个表面上,使它们以180°的角度定位,并开始沿着固体或半固体表面向鞭毛所指向的方向滑动(指明它为引导鞭毛)(红枫叶片,2009).有趣的是,鞭毛不仅与大型固体表面结合,还与沿着鞭毛膜移动的小型惰性物体(如聚苯乙烯微珠)结合。虽然这两个事件被总结为鞭毛膜运动,被认为是基于相同的分子机制,但我们假设它们始于鞭毛膜组件粘附到表面(Bloodgood和Salomonsky, 1998年).最近的一种微移管力测量方法显示,具有裁剪特性的不同模型表面上的鞭毛粘附力在1 ~ 4 nN范围内,只有表面带正电荷的鞭毛粘附力显著降低(Backholm和Bäumchen, 2019年Kreis等人,2019年Kreis等人,2018年)这些发现意味着c . reinhardtii与微藻在自然界栖息的固体表面的多样性一致,从土壤和沙子到潮湿的叶子、苔藓和树皮(哈里斯,2009).值得注意的是,20世纪80年代初的表面碘化实验显示,一种名为鞭毛膜糖蛋白1B (FMG-1B)的单一蛋白是介导表面接触的主要角色(Bloodgood和Workman, 1984年).FMG-1B仅位于鞭毛膜,其大小约为350 kDa(4389个氨基酸),较大的鞭毛外部分(4340个氨基酸)通过单一预测的22个氨基酸跨膜螺旋(Bloodgood等人,2019年).顾名思义,它是严重的N- - -O-糖基化。最近的击倒研究表明,它是鞭毛周围糖萼的主要成分fmg-1B突变体的滑翔能力急剧下降(Bloodgood等人,2019年).引人注目的是,FMG-1B在大约1小时内以高拷贝数出现并迅速翻转(红枫叶片,2009).这种快速的转换可能是由于鞭毛膜成分以鞭毛外体的形式不断地脱落到培养基中(红枫叶片,2009Wood et al., 2013).FMG-1B和另一个N-糖基化膜组分FAP113已被证明一旦与微珠结合,最终会从膜中撕裂出来(Kamiya等人,2018年).FAP113是否仅参与微珠结合或全细胞滑动尚不清楚。

最近,研究发现鞭毛与表面的粘附在光线下是可切换的,这表明蓝光光感受器信号控制着这一过程(Kreis等人,2018年).在粘附到表面之后,一个跨膜信号介导粘附事件转化为钙瞬态和蛋白质磷酸化级联反应(红枫叶片,2009Collingridge等人,2013年Kreis等人,2018年).根据目前的模型,FMG-1B的短胞质部分可能与鞭毛内运输(IFT)发生相互作用(Laib等人,2009年Shih et al., 2013).IFT沿着鞭毛微管双向移动,顺行运输由驱动蛋白2驱动,逆行运输由细胞质动力蛋白-1b驱动(科尔等人,1998年黄福等,2003Kozminski等人,1995Lechtreck 2015Pedersen和Rosenbaum的JLBT-CT在DB, 2008波特等人,1999年罗森鲍姆和威特曼,2002年).由于逆行IFT序列相对于粘附位点暂停,而FMG-1B通过其大的细胞外碳水化合物域与固体表面相连(红枫叶片,2009),逆行运动蛋白dynein-1b产生的力将微管推向相反的方向,将细胞体和第二鞭毛拖在后面;开始滑动过程(Shih et al., 2013).

由于FMG1-B的鞭毛外结构域的高n -糖基化水平,与固体表面相互作用,这表明n -糖基化可能是黏附的关键,而不是适当的糖蛋白折叠。因此,我们比较了不同受损突变株的鞭毛膜运动N-聚糖成熟(特征为Schulze et al., 2018).我们发现N-糖的成熟确实影响鞭毛和表面的相互作用的所有突变体分析。

结果

改变了的N-linked glycans并不改变FMG-1B的鞭毛定位

测试是否N高尔基体-聚糖的成熟对鞭毛表面的运动是重要的c . reinhardtii,两个插入突变体(IM),如IMMan1A,我XylT1A和他们的双突变体IMMan1AxIMXylT1A进行了研究。最初,这些突变体在Schulze et al., 2018,在那里N分析和比较上清蛋白的-聚糖模式(图1一个).产生这些突变体的插入突变在亲本株CC-4375 (aift46突变体CC-124回交)补充IFT-46::YFP,在当前的研究中称为WT-Ins。第一个突变体,木糖基转移酶1A (IMXylT1A),产生N-缺乏核心木糖的聚糖,同时具有缩短的长度Man1A是甘露糖苷酶1A的敲除突变体,其主要特征是缺失6O-甲基化甘露糖残基N-聚糖的长度略大于WT-Ins。此外,N聚糖的即时通讯Man1A末端木糖和核心焦点轻微减少。最后,对上述两个单突变体(IMMan1AxIMXylT1A(通过基因杂交获得)产生N不含6的糖O- WT-Ins长度和携带核心木糖和焦点残基的甲基化(图1一个).值得注意的是,与WT-Ins (图1 -图补充).来确认那个鞭毛N用抗hrp检测突变体与WT-Ins、全细胞提取物和鞭毛的-聚糖模式,并与β1,2-木糖和α1,3聚焦结合N多糖核心(Kaulfürst-Soboll等,2011).与之前的出版物一致,该抗体显示出更高的亲和力N-糖蛋白的合成Man1A和即时通讯Man1AxIMXylT1A而对IM探针的亲和力降低XylT1A图1 -图补充Schulze et al., 2018).进一步用刀豆蛋白A (ConA)对全细胞提取物进行凝集素-亲和素印迹,显示所有三种提取物的ConA亲和力都增加了N-糖基化突变体与WT-ins (图1 -图补充).

改变了的NFMG-1B的-糖基化并不改变其鞭毛定位。

一个)图N突变菌株的-连接聚糖组成Schulze et al., 2018并用于当前的研究。虽然我Man1A双突变体主要以较低的甲基化程度(Me)为特征,N聚糖的即时通讯XylT1A长度减少,缺少核心木糖。水平线以上所示的所有单糖都能与任何下位残基或同一水平上的任何残基结合。广场:N-乙酰氨基葡萄糖,赛丝:己糖,三角形:焦点,星形:木糖)。(B)用针对全细胞和鞭毛样本的抗体检测N-聚糖或FMG-1B的蛋白质主干(Bloodgood等人,1986年).(C)无标记质谱分析获得FMG-1B的Log2肽丰度。(D)通过无标记质谱分析获得FAP-113的Log2肽丰度。(EWT-Ins突变细胞(IMMan1A,我XylT1A或者我Man1AxIMXylT1A)和针对FMG-1B的抗体。即时通讯Man1A,我XylT1A或者我Man1AxIMXylT1A表达IFT46:: YFP。为了防止YFP信号干扰免疫染色,并直接比较WT-Ins和突变体的信号,将菌株与WT-CC124和IM的后代杂交Man1A,我XylT1A或者我Man1AxIMXylT1A缺乏用于免疫染色实验的IFT46::YFP(#37、#1和#15)(见图1 -图补充5).

由于FMG-1B是鞭毛糖蛋白组的主要组成部分,并且是迄今为止唯一被证明参与鞭毛表面运动的蛋白,因此使用针对FMG-1B的不同单克隆抗体来分析FMG-1B的定位(Bloodgood等人,1986年Long et al., 2016).全细胞提取或分离鞭毛Man1A,我XylT1A,和他们的双突变IMMan1AxIMXylT1A分别用糖基表位识别抗体或针对FMG-1B蛋白主链的抗体进行检测。在WT-Ins和所有三种突变体的全细胞和鞭毛中均发现FMG-1B。由此可见,通过使用FMG-1B蛋白特异性抗体(图1 b).而针对FMG-1B聚糖表位的抗体几乎检测不到IM的全细胞或鞭毛探针Man1A和即时通讯Man1AxIMXylT1A.此外,突变体IM中FMG-1B聚糖信号下降XylT1A,特别是在全细胞样本中。综上所述,这些免疫印迹证实NFMG-1B的-聚糖模式在突变体中被改变,而蛋白质定位不受这种改变的影响。此外,无标记质谱定量证实FMG-1B在所有分析的突变体中都能正确靶向鞭毛(图1 c).FAP113也是如此,它是另一种被证明参与鞭毛表面运动的蛋白质(图1 d).

为了比较FMG1-B在WT-Ins和突变体中的糖和蛋白定位,用上述两种fmg - 1b特异性抗体对细胞进行免疫染色。在WT-Ins的鞭毛和细胞壁中发现了一个统一的聚糖特异性抗体信号(图1 e左面板)。需要注意的是,这种与细胞壁定位糖基化蛋白的交叉反应以前曾有报道(Bloodgood等人,1986年).通过免疫印迹实验,在鞭毛和细胞壁中均未观察到多糖信号Man1A和双突变体,而突变体IM鞭毛信号强度低XylT1A图1 e,左面板和)。IM中FMG-1B信号微弱XylT1A与WT-Ins相比,当WT-Ins和IMXylT1A免疫染色前混合(图1 -图补充).当使用FMG-1B肽抗体时,WT-ins、MMan1A,我XylT1A,和突变的IMMan1AxIMXylT1A图1 e右面板)。总而言之,这些数据表明情况发生了变化N-糖的成熟不影响FMG-1B的鞭毛定位。这与Bloodgood等人的早期发现相一致,他们报道了在aN-糖基化突变体L23, cona亲和力增加(Bloodgood等人,1987年).虽然FMG-1B是鞭毛膜糖蛋白中研究最为突出和深入的,但可能还有其他糖蛋白参与鞭毛粘附。然而,与WT-Ins相比,IM菌株的鞭毛中没有发现一致且显著的蛋白质丰度变化(图1 -图补充),也表明与WT相比,突变体的鞭毛组装没有明显改变。

改变了的N-连接聚糖减弱珠附着和沿着鞭毛膜运动

c . reinhardtii聚苯乙烯微球附着在鞭毛表面,并沿鞭毛表面双向移动(红枫叶片,1981).检查改变的效果N在细胞悬浮液中加入直径为0.7 μm的微珠Man1A,我XylT1A,并对双突变体和附在鞭毛上或沿鞭毛移动的珠子数量进行量化(图2A和B的示范视频图2-video 1).在WT-Ins菌株中,约52%的鞭毛至少有一颗珠附着,而在IM菌株中,鞭毛至少有一颗珠附着的比例下降到46%Man1A, 33%在即时通讯XylT1A在双突变体中为27%(图2一个).在附着的小珠中,37%沿WT-Ins鞭毛移动,22%沿IM移动Man1A即时通讯29%XylT1A在双突变体中为27%(图2 b).源数据图2可以在图2源数据.这些数据表明,鞭毛膜与鞭毛表面的相互作用是由于鞭毛的改变而改变的N-聚糖组成。

改变了的N-糖基化减少鞭毛聚苯乙烯珠的附着和-运输。

一个鞭毛上至少有一个聚苯乙烯珠的百分比。用直径0.7µm的聚苯乙烯微球孵育细胞,然后用光学显微镜分析。(B)至少结合一个聚苯乙烯珠沿鞭毛运输的聚苯乙烯珠的百分比。结果显示平均3个重复,每个重复分析50个细胞。误差条显示三个重复的扫描电镜。采用t检验进行统计分析。源数据可以在图2源数据

用原子力显微镜定量鞭毛介导的粘附

利用原子力显微镜(AFM)测量鞭毛介导的表面粘附力(图3一).在这里,附着在盖玻片上的细胞通过物理接触附着在AFM悬臂上(Liu et al., 2011).随后,将AFM悬臂向上拉,并记录拉细胞所需的力(图3 b).在测量过程中,为了抑制整个细胞的滑动,纤毛蛋白D被用来抑制dynein-1b的活性,从而抑制细胞的滑动(Firestone等人,2012年).值得注意的是,克服粘着力所必需的c . reinhardtii与WT-Ins相比,这三种突变体的鞭毛明显减少(图3B及C).特别是在双突变体中,粘附力由WT-Ins中的8 nN降低到1 nN,平均能量由4 J nm降低到0.5 J nm−1图3C和D).源数据可以在图3 -源数据.这一结果表明N-聚糖组成影响鞭毛对固体基质的粘附力。

用原子力显微镜定量鞭毛介导的粘附。

一个)力测量实验程序示意图:细胞粘附表面(1);附着在AFM悬臂梁上的单元(2);通过AFM悬臂梁将细胞从表面拉起(3)。请注意,在本文所述的所有测量中,逆行IFT,即纤毛蛋白D抑制了滑翔。(B)获得应变(WT, IM)的代表力曲线Man1A,我XylT1A,我Man1AxIMXylT1A.(CWT-Ins的鞭毛粘附力,IMMan1A,我XylT1A,我Man1AxIMXylT1A由力曲线(B).(D) WT-Ins、IM的平均鞭毛粘附能Man1A,我XylT1A,我Man1AxIMXylT1A.进行3次生物重复,每次至少检测5个细胞。p值是通过双侧、两个样本的均值t检验得到的。源数据可以在图3 -源数据

用微吸管力测量方法定量鞭毛粘附

为了验证AFM的附着力测量,一种独立的体内力测量方法(Backholm和Bäumchen, 2019年Kreis等人,2018年)与另一种遗传背景突变体xylosyltransferase 1A (CRISPRXylT1A_1),在亲本野生型SAG11-32b (WT-SAG)中通过CRISPR/Cas9 (图4 -图补充).使用该方法揭示了鞭毛粘附与波长的相关性(Backholm和Bäumchen, 2019年),在精确控制的蓝光和红光条件下,使用微管黏附力测量方法测量相同细胞的黏附力。在存在和不存在dynein-1b抑制剂ciliobrevin d时测量粘附力。重要的是,CRISPR中的粘附力XylT1A_1在ciliobrevin D条件下,与各自的WT相比显著减少,证实了AFM结果(图4).用红光照射细胞,WT-SAG和CRISPR的粘附力均显著降低XylT1A_1值得注意的是,纤毛蛋白酶D的去除导致WT-SAG和CRISPR的粘附力显著下降XylT1A_1WT-SAG为~2.6 nN ~1.3 nN, CRISPR为~1.8 nN ~1 nNXylT1A_1.源数据可以在图4源数据

用微吸管力显微镜评估鞭毛粘附力。

为WT-SAG和在WT-SAG(CRISPR)遗传背景下产生的木糖基转移酶1A突变体获得的鞭毛介导的粘附力XylT1A_1).在有或无ciliobrevin D的情况下,在蓝光和红光下对两种菌株进行相同细胞的微量移液管力测量。描述了每个细胞10次测量的平均值,对平均值进行了统计分析。从Kolmogorov-Smirnov试验中获得的p值分别为(从上到下):(***)p=0.0004、(***)p=0.0016、(*)p=0.0491、(***)p=0.0009。源数据可以在中看到图4源数据

改变的效果N-糖基化对IFT和滑翔的影响

提出了在图3,在双突变体IM中观察到对粘附力的最强影响Man1AxIMXylT1A与WT-Ins相比。在ciliobrevin D缺失的情况下,AFM测定了突变体IM的黏附力Man1AxIMXylT1A仍然显著低于WT Ins中的值(图5一个).这与WT-SAG和CRISPR是一致的XylT1A_1在没有纤毛蛋白D (CRISPR)的情况下进行微管粘附力测量XylT1A_1具有较低的附着力(图4).有趣的是,纤毛蛋白酶D的添加显著增加了WT-SAG或WT-Ins的粘附力(图4图5一个).综上所述,这些结果表明,活性动力蛋白1b可能降低表面粘附力。另一方面,也暗示了IFT可能通过改变而受到阻碍N-糖基化作用对表面黏附力的影响较小N糖基化突变体。因此,表达WT-Ins和IM的IFT46::YFP的IFT速度和滑翔能力Man1AxIMXylT1A使用全内反射荧光(TIRF)显微镜进行评估。在斐济软件kymographs的帮助下,手动评估由TIRF显微镜生成的黏附细胞视频(图5 b).所获得的数据表明,两者所占比例均为滑动事件(滑动速度较高0.3µm*s)−1),相比WT-Ins和双突变体(图5 c).同样,在WT-Ins值与贴壁细胞的双突变体(图5 c),暗示改变无显著影响N-糖在IFT上成熟。源数据图5可以在图5源数据.最后,为了排除纤毛蛋白D可能由于毒副作用导致粘附力升高的可能性,我们生成了三重突变体dynein-1btsX即时通讯Man1AX即时通讯XylT1A42 #跨越我Man1AxIMXylT1A与cc - 4423 (图5 -图1A-C附录).CC-4423的特点是表达一种温度敏感的dynein-1b转录本,导致dynein-1b在限制性温度下耗尽,随后衰减逆行IFT和鞭毛分解(恩格尔等人,2012年).随后,在限制温度下,即模拟纤毛蛋白D依赖的动力蛋白1b不活性的条件下,通过AFM测量粘附力。由于不能排除由温度变化引起的鞭毛缩短(图5 -图补充1D)、可能影响鞭毛黏附力的3个突变体,以20 mM NaPPi处理的3个突变体作为对照。事实上,当鞭毛长度为6.5 μm时,细胞的粘附力是不同的:对照组细胞的平均粘附力为0.48 n,而去除dynein-1b的细胞粘附力显著提高为1.64 n。重要的是,NaPPi只导致鞭毛缩短(图5 -图补充1E),但不影响dynein-1b (Dentler 2005),因此观察到的差异与dynein-1b的作用直接相关。因此,我们认为,动力蛋白1b的作用降低了鞭毛粘附力,这是由于表面粘附蛋白簇的不稳定。

IM中IFT和滑翔不受影响男士一一个xIMXylT1A

一个) WT-Ins和双突变体IM的粘附力男士一一个xIMXylT1A在没有或存在纤毛蛋白D的情况下,分别通过AFM。进行3次生物重复,每次至少检测5个细胞。(B)利用TIRF显微镜获得WT-Ins鞭毛IFT46::YFP运动的代表曲线,用于计算滑动速度和IFT。白色箭头:无滑动事件(v < 0.3µm*s)−1);绿色箭头:滑动事件(v > 0.3µm*s)−1);红色箭头:IFT顺行;蓝色:IFT逆行。(C)与WT-Ins相比,双突变体IFT和滑翔没有明显改变。滑行项目比例(左)、滑行速度(不含非滑行项目;中间),IFT速度在任何方向(右)。3个生物重复,每个重复评估10个细胞,在IFT速度的情况下对应300 IFT /重复/菌株。条形图中的误差条表示三个重复的标准差。采用学生t检验比较各重复项的平均值在滑翔项目比例和IFT速度方面的差异。采用Mann-Whitney U检验分析滑翔速度分布,n为实测滑翔项目数。在ciliobrevin d缺失的情况下进行了滑翔和IFT分析图5源数据

讨论

我们的数据显示N-聚糖对鞭毛介导的细胞粘附有影响c . reinhardtii。同时,IFT和滑翔速度没有因改变而改变N糖基化。

IM菌株的微珠结合减弱,表明鞭毛表面对微珠的亲和性改变。与此同时,与WT-Ins相比,它们的表面附着力显著降低。AFM数据通过评估另一个通过CRISPR/Cas9创建的XylT1A突变体,使用微移管力测量得到证实。应该指出的是NIM的-聚糖模式XylT1A和CRISPRXylT1A具有可比性,从而加强了XylT1A作为核心木糖基转移酶的作用(卢卡斯等人,2020年Schulze et al., 2018).力测量WT应变和N-糖基化突变体的AFM和微吸管力测量证实了这一差异N-聚糖成熟,即改变N-聚糖结构附着在成熟蛋白质上,降低鞭毛对表面的粘附力。这些黏附力的变化并不伴随着鞭毛蛋白质组的一致的剧烈变化。例如,FMG-1B和FAP113,迄今为止仅有的两种与表面粘附有关的蛋白,在WT-Ins和突变体中发现了相当数量的蛋白(图1图4 -图补充Bloodgood等人,2019年Kamiya等人,2018年).值得注意的是,FMG-1A也定位于鞭毛,它的丰度在WT和营养细胞中的突变体之间没有改变(图1 -图补充).这与目前认为FMG-1A仅在生殖细胞中表达的假设形成了对比,并提出了一个问题:鉴于这两种蛋白质高度相似,它是否可能与FMG-1B具有类似的作用(红枫叶片,2009).有趣的是,突变株在固体表面的滑动没有受到影响。目前的鞭毛介导的细胞粘附和随后的滑翔模型提出,某些糖蛋白(如FMG-1B)的细胞外部分粘附在表面,这些蛋白的细胞质部分直接或间接地结合到正在进行的逆行IFT上的钙和光依赖刺激,随后开始滑动(Kreis等人,2018年Shih et al., 2013).假设改变了N-糖的成熟并不会影响ER中最初的蛋白质折叠(因为这些步骤在空间和时间上是分开的),我们的数据显示这一点发生了改变N-糖基化,不改变相应糖蛋白对鞭毛的靶向作用,也不改变IFT的速度。因此,表面附着力的变化可能与N-糖蛋白表位及其与固体或半固体表面的直接相互作用。具体如何N-糖基调控粘附力是未来的研究课题,特别是考虑鞭毛介导的粘附力c . reinhardtii已被证明在很大程度上不受不同基板表面性质的影响(Kreis等人,2019年).

值得注意的是,在双突变体和WT-Ins之间IFT和滑翔没有改变(图5).改变了的事实N-糖基化降低了细胞对表面的粘附力,但对IFT没有影响,强烈提示表面粘附和IFT不一定耦合。正如下面所讨论的,粘附可能是独立于使细胞滑动的必要性而进化的。

此外,可以得出结论N-糖基化对光感知没有显著影响,因为WT-SAG和CRISPR的粘附力XylT1A在蓝光下明显强于红光下(图4).

总之,利用单细胞黏附力测量,我们的数据显示,细胞黏附明显受损c . reinhardtii N糖基化突变株。我们的数据进一步表明,n -糖基化改变不影响鞭毛的组装、IFT和FMG-1B向鞭毛的运输,表明n -糖基化在这些过程中没有作用。相反,鞭毛蛋白的适当的n -糖基化对于将莱茵氏菌细胞粘附在表面是至关重要的。我们的观察进一步表明,尽管n -聚糖突变体的粘附力减弱,但仍然足以进行滑翔。考虑到鞭毛粘附对蓝光的反应,它可能会将粘附与光保护联系起来,这也是蓝光介导的,因为粘附可能通过生物膜形成光保护,进而使细胞相互遮荫(Kreis等人,2018年Petroutsos et al., 2016).

材料和方法

文化发展

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细胞在恒定光照下50µmol光子*s的三乙酸磷酸盐(TAP)培养基中异养生长−1*厘米−2除非另有规定。

鞭毛长度和鞭毛细胞的测量

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用0.5% Lugol溶液在室温下固定细胞1小时。鞭毛长度测量使用配备电子倍增电荷耦合装置的相显微镜(尼康Eclipse Ti)。对于每个样本,至少测量了50条鞭毛。为了测量鞭毛细胞,每一株至少有100个细胞被计数在生物三重复中。

CRISPR/Cas9突变株的产生与分析

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对WT菌株SAG11-32b进行诱变,诱变方法如下Greiner等人,2017年利用预先构建的Cas9:guideRNA复合物的转化(XylT1A基因中的Cas9靶区:ACGAACACCCCAACACCAAT),同时通过电穿孔编码巴龙霉素耐药质粒。用巴龙霉素进行筛选后,利用引物short_fw进行PCR筛选推测突变体:TACAAAGAACGGGACGCAGGshort_rev:CATTGAAGCTCATCCAGACAC和long_fw:AAGGGTCACGGCACGGTATGlong_rev:CCTGAAGCACCCATGATGCACG.基因组XylT1A候选菌株显示非wt样带模式的区域进行了测序。总之,在Cas9剪切位点后插入的DNA中发现了两个不同的突变株(CRISPR)XylT1A_1和CRISPRXylT1A_2).然后通过平行反应监测(PRM)和上清液定量XylT1A蛋白水平N-聚糖组成采用IS-CID质谱分析。此外,鞭毛被分离,通过SDS-PAGE分离,转移到硝基纤维素膜后,用蛋白主链fmg - 1b特异性抗体进行检测。

鞭毛隔离

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从中对数生长期的培养物中分离鞭毛,用pH值冲击法(威特曼等人,1972年).含有鞭毛样本的微球保存在−80°C,直到进一步用于免疫印迹或质谱测量的样品制备。

免疫印迹

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冷冻干燥的鞭毛和全细胞样本resuspended裂解缓冲(10毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液pH = 7.4, 2% SDS, 1毫米苯甲脒PMSF和1毫米)和受到声波降解法造粒后10分钟。细胞碎片,使用bicinchoninic酸测定的蛋白质浓度测定热科学皮尔斯(BCA蛋白质分析工具包)。用SDS-PAGE分离30µg蛋白,转移到硝基纤维素膜上,如图所示与抗体孵育。

用刀豆蛋白A和HRP进行凝集素-亲和素印迹

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冷冻干燥的全细胞样本resuspended在裂解缓冲(10毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液pH = 7.4, 2% SDS, 1毫米苯甲脒PMSF和1毫米)和受到声波降解法造粒后10分钟。not-soluble细胞碎片,使用bicinchoninic酸测定的蛋白质浓度测定热科学皮尔斯(BCA蛋白质分析工具包)。用SDS-PAGE分离50µg蛋白,转移到硝化纤维素膜上。用ConA(1µg/mL, TBST + 1 mM CaCl)孵育膜2+1毫米二氧化锰2)在室温下加热1.5小时。随后用HRP(5µg/mL TBST + 1mm CaCl)清洗膜并孵育1小时2+1毫米二氧化锰2).过量的HRP和Ca2+和锰2+经TBST三次洗涤去除,然后经ECL进行亲和印迹显影。

质谱测量的样品制备

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冻干鞭毛和全细胞标本按免疫印迹法处理。如其他文献所述,60µg蛋白质经胰酶消化和脱盐后的体积(Rappsilber等人,2007).

质谱测量

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用2% (v/v)乙腈/0.1% (v/v)甲酸在超纯水中重组Tryptic多肽,并使用Ultimate 3000 rslnano系统(Thermo Scientific)进行分离。随后,样品被加载到trap柱(C18 PepMap 100, 300µm × 5 mm, 5 mm粒径,100 Å孔径;用0.05% (v/v) TFA/2% (v/v)乙腈在超纯水中以10µL*min的流速脱盐5分钟−1.随后,在分离柱(Acclaim PepMap100 C18, 75 mm i.D, 2 mm粒径,100 Å孔径;长度为50厘米。一般的质谱(MS)参数列于表1

表1
女士的参数。

利用相关参数获取IS-CID和非碎片化的TopN质谱以及PRM数据。

TopN没有IS-CID 源内CID HCD 平行反应监测
洗脱液成分 肽捕获:0.05%三氟乙酸(TFA)在超纯水(A1), 0.05%三氟乙酸(TFA)在80%乙腈(B1)
肽分离:0.1%甲酸(FA)在超纯水(A2), 0.1% FA在80%乙腈(B2)
液晶参数
陷阱列 C18 PepMap 100, 300µM x 5 mm, 5µM粒径,100 Å孔径;热科学
肽捕获
(洗脱液A1 + B1)
2.5% B1, 5 μL/min,作用5min 2.5% B1, 10 μL/min,作用3 min
流量 300 nL /分钟 250 nL /分钟
分离柱 Acclaim PepMap C18, 75µm x 50 cm, 2µm粒径,100 Å孔径;热科学
肽分离梯度
(洗脱液A2 + B2)
2.5% B2超过5分钟,
2.5-45% B2超过40分钟,
45 - 99% B2超过5分钟
用99% B2治疗20分钟
99-2.5%超过5分钟
2.5%浸泡30分钟
2.5% B2超过5分钟,
2.5-35% B2超过105分钟,
35 - 99% B2超过5分钟
用99% B2治疗20分钟
99-2.5%超过5分钟
2.5%持续40分钟
将CID 80年电动汽车 MS1设置
使用锁的质量 在(445.12003 m / z)
决议在m / z200(应用) 70000年
色谱峰宽 15秒
自动增益控制目标 3 e6
最大注射时间 100毫秒 50毫秒
扫描范围 600 - 3000 m / z 350 - 1600 m / z
质量标签
TopN 12 N/A 一设置
决议在m / z200(应用) 17500年 35000年
隔离窗 2 m / z 2米/z(偏移0.5米/z)
自动增益控制目标 1 e5
最大注射时间 120毫秒
归一化碰撞能 30. 27
最小AGC目标 1.25 e3 N/A
强度阈值 1 e4 N/A
电荷排斥 未赋值的,> 5 N/A
动态的排斥 15秒 N/A

对于糖基转移酶的定量,在全细胞样本中使用PRM(包括靶标列表),并使用Skyline软件分析各自的光谱(Pino等人,2020年)。为了量化鞭毛蛋白,在标准、非靶向、数据依赖的测量中测量生物四倍体中的鞭毛样品。随后,使用ProteomeDiscoverer计算肽蛋白丰度比(IM/WT)(在一组非膜直立鞭毛蛋白上标准化)并对至少11个样品中鉴定的蛋白质、至少一个比率的丰度比Adj.p值<0.05的蛋白质以及鞭毛蛋白质组ChlamyFPv5中出现的蛋白质进行过滤(Pazour等,2005).

为了分配糖肽类,我们使用上文所述的源内碰撞诱导解离法(IS-CID)测量样品,然后使用Ursgal和SugarPy (Kremer等人,2016年奥尔特曼斯等人,2019年Schulze等人,2020年).

Microbead测量

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微珠结合和转运测定与前面的描述类似。(Bloodgood等人,2019年单分散聚苯乙烯微球(直径0.7 μm)购自Polysciences, Inc。用去离子水洗涤三次,再用NFHSM重悬制成贮存液,稀释1:10用于粘附和运动检测实验。

为了量化珠的结合能力,将珠以2 × 10的密度添加到500 μL的细胞中7细胞* mL−1.5分钟后,用光学显微镜(Olympus, U-HGLGPS, 100X油镜)观察细胞。如果鞭毛上有珠状物,鞭毛就被标记为“+珠状物”。鞭毛结合珠百分比计算为:鞭毛结合珠百分比=‘+珠数’/(评分的鞭毛总数)× 100%。

为获得表面运动的动力学测量,将细胞与上述小球混合5min,在光镜下随机观察。观察粘在鞭毛上的每一颗珠子约30秒。如果珠子沿着鞭毛移动,我们就标记为“移动珠子”或“粘附珠子”。表面运动计算为:随鞭毛移动的珠粒百分比= '移动珠' x/('移动珠' + '粘附珠')100%。

AFM测量

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c . reinhardtii白色恒定光照下M1培养基中培养的菌株生长65小时,允许在新鲜M1培养基中粘附玻片(乙醇浸泡过夜,然后用MQ水冲洗)15分钟。细胞在纤毛蛋白D存在的情况下孵育1小时(500µL M1中添加200µM纤毛蛋白D)。AFM测量仅分析外观近似相似的滑膜状黏附细胞。MLCT-O10 AFM探头(Spring Const。0.03 N m−1取长215µm,宽20µm,共振频率15 kHz,布鲁克(Bruker),用丙酮浸泡5分钟,然后紫外照射(距灯3-5 mm) 15分钟,然后用0.01%聚赖氨酸浸泡1小时,然后用MQ水冲洗。随后,探头用2%戊二醛浸泡1小时,使用前用MQ水冲洗。使用配备CellHesion stage (Z范围:100µm)的NanoWizard 3 AFM (JPK)在室温下的液体力谱模式下进行AFM测量。采用接触式热噪声法对悬臂梁的弹性常数进行常规标定。修饰过的AFM针尖以10 μm s的速率降至细胞表面−1z尺度为25 μm。接触后,施加的力维持在3 nN 15 s。然后,以1 μm s的速率将附着在细胞上的探针提升−1.用JPK SPM数据处理(JPK)处理力曲线。力和能量的确定如图3-图补编1Liu et al., 2011).进行3次生物重复,每次至少检测5个细胞。

微量吸液管力的测量

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细胞培养生长和微移液管力测量是按照既定的配方进行的(Kreis等人,2019年Kreis等人,2018年).简而言之,c . reinhardtiiWT-SAG和CRISPR菌株XylT1A_1在Memmert IPP 100Plus培养箱中,在三乙酸-磷酸盐(TAP)培养基(Thermo Fisher Scientific)中进行无轴化培养,每天12小时/晚上12小时。该实验方法是基于使用自制的微吸管力传感器,它允许通过吸力抓取活细胞(Backholm和Bäumchen, 2019年).通过测量吸管尖端蒸发水滴的重量所引起的偏转来校准微吸管。粘附力是通过将鞭毛与用超声波在乙醇中清洗的硅片(单边抛光,Si-Mat)接触,以及在以1µm*s移动的衬底迭代接近和缩回过程中测量微移管的偏转来获得的−1.底物处理方法包括推动细胞,使微管偏离细胞/底物接触位置10µm,随后停留10 s。然后以相同的速度将底物从细胞/底物接触位置缩回30µm。鞭毛与底物的总接触时间约为30 s。蓝光和红光的照明波长分别为470 nm和671 nm,通过在倒置显微镜(Olympus IX-73和IX-83)的聚光镜顶部添加窄带通干涉滤光片(FWHM: 10 nm)实现。在粘附力测量过程中,用恒定的光子通量1019光子*m照射电池−2*年代−1适用于两种光照条件。对于每个细胞,对每个波长进行10次黏附力测量,连续5次测量后随机改变红蓝光的顺序。

为了评估纤毛霉素D对粘附性的影响,在9:1水:二甲基亚砜(DMSO,纯度:99.9%,Sigma-Aldrich)混合物中制备了纤毛霉素D(默克)200 μM原液。然后,在30 mL培养液中加入1.08 mL原液,使细胞悬液中纤毛蛋白D的最终浓度为7 μM。的c . reinhardtii含纤毛蛋白酶D的悬浮液孵育30分钟,100 g离心10分钟,在培养箱中至少静置30分钟。最后,用约15 mL的细胞悬液填充液体腔。平行地,第二次悬挂c . reinhardtii使用相同比例的DMSO(但不含纤毛蛋白D)孵育细胞,随后采用完全相同的实验程序作为对照组。

TIRF成像

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全内反射显微镜(TIRF)用于评价IFT和滑动行为c . reinhardtii表达yfp偶联IFT46的菌株。因此,将细胞密度调整为1 × 105细胞* mL−1.样品装入玻璃底显微镜室(µslide 8 Well glass bottom),成像时每20分钟刷新一次。TIRF显微镜在室温下使用尼康Eclipse Ti和100倍物镜。IFT46::YFP在488 nm激发,用iXon Ultra EMCCD相机(Andor)记录荧光。为了进行分析,使用NIS-Elements软件在30秒内以10 fps、0.158µm*pixel的分辨率捕获图像−1.图像通过使用斐济通过kymograph的手工评估进行评估。通过减去相应的滑翔速度计算出滑翔时的净IFT速度。3个生物重复,每个重复分析10个细胞的滑动结构。

共焦成像

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细胞与一抗(FMG-1B #8和#61,可在dshb.com),随后用荧光标记的二抗孵育,并如前所述通过共聚焦显微镜进行分析(吕等人,2017).总之,细胞被镀1%聚吖丙啶)涂布封面玻璃,使脱色和固定在甲醇−20°C 20分钟,弥漫在PBS缓冲细胞1小时,然后屏蔽5% BSA (Biosharp), 10%正常山羊血清(Dingguo)和PBS鱼明胶(σ)1%。用一抗过夜孵育,洗净,再用二抗孵育,洗净,用指甲油贴在载玻片上。用徕卡共聚焦显微镜(SP8)检查载玻片。利用LAS X软件(徕卡)和ImageJ软件进行图像采集和处理。采用488 nm激光,YFP激发波长510 nm,发射波长525 nm,曝光时间200 ms。

交配和四分体分析

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阳性菌株和阴性菌株在2 mL TAP-N (2 × 10)培养基中培养7细胞/mL)在连续光照下过夜,用于配子发生。0.5 mL加、负配子混合,孵育2小时交配。然后将0.15 mL混合物分散到成熟平板(4%琼脂)上。静置5 d,光照24 h。用剃刀片将未配子从成熟培养皿中取出,用氯仿杀灭30 s。将含有约30个合子的琼脂切下来,转移到1%琼脂的萌发板上。在强光下孵育平板,直至孢子从受精卵中释放出来,然后在切好的琼脂中加入100 μL水,在整个平板上分散。在3-5天内出现单克隆,并选择单克隆进行进一步分析。

材料和通信

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质谱蛋白质组学数据已存入ProteomeXchange联盟(http://proteomecentral.proteomexchange.org)通过PRIDE合作伙伴存储库,数据集标识符为PXD018353,并将在手稿接受后公开(Perez-Riverol等人,2019年).如有需要,请联系K. Huang (huangky@ihb.ac.cn)或M. Hippler (mhippler@uni-muenster.de)。

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  50. 50
  51. 51
  52. 52

决定信

  1. Piali森古普塔
    高级编辑;美国布兰迪斯大学
  2. 艾哈迈德Yildiz
    检查编辑器;加州大学伯克利分校,美国
  3. 罗伯特红枫叶片
    评论家
  4. 费利克斯·里科
    评论家

为了提高透明度,eLife会发布最实质性的修订请求以及相应的作者回复188bet体育电竞。

验收总结:

本文探讨了双鞭毛细胞粘附的基础衣藻这对这些细胞在不同环境中生存的能力是非常重要的。底物附着在衣藻是由于鞭毛膜蛋白FMG-1B。这篇论文表明,突变破坏NFMG-1B的-糖基化并不改变其丰度和鞭毛定位,但降低了细胞对固体底物的粘附强度。

同行评审决定信:

谢谢你提交你的文章“改变N-聚糖组成影响鞭毛介导的细胞粘附衣藻reinhardtii"供…考虑188bet体育电竞.你的文章已经经过了三位同行审稿人的审核,评审工作由一位审稿人和资深编辑Piali Sengupta监督。以下参与审查你提交的作品的人同意透露他们的身份:Robert Bloodgood(审稿人1);Felix Rico(第二名审稿人)。

审稿人相互讨论了这些评论,审稿人起草了这个决定,以帮助您准备修改后的提交。

随着编辑认为你的手稿感兴趣的,但如下所述,额外的实验需要在发布之前,我们想要吸引你的注意力的变化我们修订政策,我们在应对COVID-19 (//www.danecarr.com/articles/57162)。188bet体育电竞首先,由于许多研究人员暂时无法进入实验室,我们会给作者足够的时间提交修改后的稿件。我们还提供,如果你选择,将手稿发布到bioRxiv(如果它还没有在那里)连同这个决定信和正式的指定,手稿是“在修订中188bet体育电竞".请让我们知道,如果你想追求这个选择。(如果你的作品更适合medRxiv,你需要自己发布预印本,因为我们这样做的机制仍在开发中。)

简介:

本文探讨了双鞭毛细胞粘附的基础衣藻基板。底物附着在衣藻是由于鞭毛表面。FMG-1B构成了衣藻是主要的表面暴露的鞭毛膜蛋白,也是唯一的鞭毛膜蛋白,在整个细胞的滑动运动中接触平面底物,或在与鞭毛相关的其他表面运动表现中接触聚苯乙烯微球。作者提出了一个相当直接的问题,即是否在N-鞭毛膜糖蛋白的糖基化影响鞭毛细胞粘附的强度衣藻衬底。这项研究使用了之前描述过的两种插入突变体IMMan1A(甘露糖苷酶)和IMXylT1A(在木糖基转移酶1A中),相应的双突变体和新的CRISPR突变体(CRISPRXylT1A_1也用木糖基转移酶1A)来分析蛋白质的变化N-糖基化作用影响鞭毛对表面的粘附衣藻

结果表明,改变了NFMG-1B的-糖基化并不改变其丰度和鞭毛定位,也不改变细胞的IFT和滑动速度。然而,它影响聚苯乙烯微珠与鞭毛的结合,以及鞭毛的运输。此外,AFM测量显示,与WT菌株相比,突变体的力和平均能量都有所下降。此外,对应变进行了微吸管力测量N使用CRISPR方法改变的-聚糖组成也显示出在蓝光下突变细胞的粘附力下降(已知增强了WT参考的粘附力)。最后,使用和不使用纤毛蛋白酶D的测量结果表明,纤毛蛋白酶D并没有增加突变细胞的粘附力,这与WT细胞所观察到的相反。

而审查员也认为N-糖基化模式影响细胞黏附水平,可能是一个有趣的结果值得报道188bet体育电竞,他们还指出了主要的弱点,并对手稿中所作结论的有效性和该手稿在这一领域所取得的进展提出了严重关切。具体地说,关键的AFM和微管实验,虽然非常优雅和巨大的潜力,如之前的出版物所示,是在药物存在的情况下进行的,这似乎会杀死和破坏许多细胞。糖基化的改变是否直接影响粘连或改变蛋白折叠或纤毛蛋白组成尚不清楚。而且,突变并不能消除N-糖基化,但改变组成和大小,提出了这些变化如何干扰粘附的问题,考虑到双突变体在抗hrp染色中显示了微妙的变化。因此,小组建议,目前这种形式的工作还太初级,不宜考虑发表188bet体育电竞,对原稿进行一次大的修改会使其受益匪浅。以下列出的要点为如何改进手稿提供了明确的指导。

必要的修正:

1)显示出控制与控制之间的“粘附力”差异xylT1A突变体在图4A和3C中是不同的,这可能是由于方法的不同。然而,由于使用了不同的菌株,也有可能在粘附表型上存在很大的菌株特异性差异(使用了两个不同的野生型菌株),这并不一定与感兴趣的突变有关。由于没有提出挽救实验,基因型和相当可变的表型之间的相关性有点不确定。

2)抗hrp双突变体鞭毛提取物染色得到的图案与野生型鞭毛十分相似。这与双突变体中黏附力受影响最大的观察结果如何?关于蛋白糖基化,双突变体比两个单突变体更好(例如,单突变体抗hrp结合减少,双突变体抗hrp结合恢复正常),但没有解释为什么会这样。Schulze等人指出,甘露糖苷酶的缺失抑制了XlyT1A突变,但是——因为它被称为敲下突变——Man1A突变似乎不是null?

3)观察到Ciliobrevin D(一种IFT动力蛋白抑制剂)处理增加了粘附力。然而,如材料和方法部分所述,纤毛霉素d处理细胞时,许多细胞死亡。因此,这里所观察到的效果是否真的是由于动力蛋白的抑制,还是由于药物的某些毒性,尚不清楚。

“纤毛霉素D对粘附力的影响表明IFT可能有助于表面粘附力。”但未观察到IFT的差异。那么,作者如何解释纤毛酶的作用呢?主动滑翔是否会降低附着力?

由于纤毛蛋白D被认为可以抑制IFT动力蛋白,该小组建议使用通过温度变化(如fl10ts)来消除IFT的菌株,以进一步探索活性IFT是否会降低细胞粘附。

作者应该讨论这些约束措施的性质和相关性。在现实生活中,这种生物体的自然表面是什么?当聚苯乙烯(珠子),玻璃(AFM)和硅(微管)呈现出所有相似的表面电荷时,在这项工作中报告了什么样的相互作用?为糖与表面之间的相互作用提供一个合理的描述将是有用的。

手稿复杂,难以阅读,作者可以更好地解释他们的一些实验背后的逻辑。为了引导读者通过众多的变化,一些细节应该更明确地列出。特别地,讨论的最后一部分,关于纤毛蛋白D的影响及其与滑翔的联系,可能可以更清楚地解释和进一步讨论。一些细节目前还没有给出一个清晰的概述。

[编者注:在接受之前建议进一步修订,如下所述。]

谢谢你提交你的文章“改变N-聚糖组成影响鞭毛介导的细胞粘附衣藻reinhardtii"供…考虑188bet体育电竞.你的文章已经经过了三位同行审稿人的审核,评审工作由一位审稿人和资深编辑Piali Sengupta监督。以下参与审查你提交的作品的人同意透露他们的身份:Robert Bloodgood(审稿人1);Felix Rico(第二名审稿人)。

审稿人相互讨论了这些评论,审稿人起草了这个决定,以帮助您准备修改后的提交。

我们希望提请大家注意我们为应对COVID-19而作出的修订政策的变化(//www.danecarr.com/articles/57162)。188bet体育电竞具体来说,我们要求编辑们立即接受像你这样的稿件,他们认为可以作为188bet体育电竞论文没有额外的数据,即使他们觉得他们会使手稿更强大。因此,下面要求的订正只涉及清晰度和表述。

简介:

作者做出了值得赞扬的努力,解决了众多评论和要求的审稿人,并进行了新的实验,以回应审查。这导致了一个大大改进的手稿,将更容易为读者理解。本文对细胞黏附(特别是鞭毛黏附)领域作出了有价值的贡献,可能会引起许多读者的兴趣188bet体育电竞前提是他们可以修改他们的手稿,以回应以下的剩余问题。

修正:

1)“减少N-聚糖的复杂性阻碍了鞭毛与表面结合所需的粘附力,正如力光谱学所证明的那样,并损害聚苯乙烯珠的结合和运输。”

在这句话的开头解释使用的方法时,删除“如力谱所示”。重要的是要澄清“……减少。N-糖基化降低鞭毛的粘附力。这导致珠子的运动性降低,但细胞在固体表面不能滑动。”

2)“由于逆行的运动动力蛋白1b相对于粘附暂停了……”

Shih等人认为,是逆行的IFT序列在粘附位点停留,动力蛋白1b发动机携带这些暂停序列将轴突向相反的方向牵引。

3)“考虑到N-糖蛋白本身对粘附是重要的,但经常从鞭毛膜丢失,滑行需要大量的能量,这表明鞭毛介导的粘附具有某种高度的重要性。此外,它还提出了一个问题,是否成熟的N-聚糖(作为额外的能量消耗)在鞭毛介导的粘附中是重要的,即是否N-糖基化对粘附至关重要,而不是糖蛋白的正常折叠。”

关于ATP成本的推理是相当抽象和不相关的。这一节应该从原稿中删除。相反,作者可以在导言中指出衣藻物种通常生长在固体表面(然后可能通过滑行移动),而不是生活在水生栖息地。因为很多衣藻鞭毛可以在多种表面(土壤、沙土、湿叶、苔藓和树皮)上生存,鞭毛的表面附着系统没有发展出很高的特异性,但具有很大的灵活性。

4)“两个插入突变体,如IMMan1A,我XylT1A和他们的双突变体IMMan1AxIMXylT1A研究了。”

此处将IM定义为插入突变体。

5)“这改变了N-糖的成熟不影响FMG-1B的鞭毛定位。"

作者应引用Bloodgood, Salomonsky and Reinhart, 1987,本文图5与原稿图1结果相同。本文还报道了糖基化缺陷FMG-1B突变体与刀豆蛋白A的结合增加。

6) “由于不能排除温度变化引起的鞭毛缩短(图5-图补遗1D)影响鞭毛粘附力,AFM将用20 mM NaPPi处理的三重突变体作为对照进行评估。”

目前还不清楚为什么使用NaPPi治疗作为对照。因为不能排除鞭毛缩短?黏附力是否与鞭毛长度有关?

7)“可以推测,dynein-1b的作用降低了鞭毛粘附力,因为它的作用方向与鞭毛粘附力相反。”

目前尚不清楚作者所说的“相反的行动方向”是什么意思。这是否意味着IFT动力蛋白将膜从底物上拉离?或者,在暂停的IFT列车上,动力蛋白马达产生的力会将FMG1B簇从表面分离出来,有效地降低鞭毛的粘附力吗?

8)“值得注意的是,FMG-1A也定位于鞭毛(但是),它的丰度在WT和营养细胞中的突变体之间没有改变(图1 -图补充4)。”

这里还不清楚结论是什么。

9) “我们的数据进一步表明鞭毛装配……”。

作者应该更清楚地说明:N-糖基化在鞭毛伸长、IFT和FMG-1B中是不需要的,但在鞭毛表面与固体基质的粘附以及在鞭毛中粘附力减弱时是需要的N-聚糖突变体仍然足以滑翔。我们建议删除“这表明粘附的进化可能不仅仅是由滑翔能力决定的,而是由粘附本身的必要性决定的。”

10) “鉴于鞭毛粘附对蓝光的反应,它可能将粘附与蓝光介导的光保护联系起来,因为粘附可能通过细胞阴影产生光保护。”

作者在这里用阴影表示的意思尚不清楚。仅仅因为一个细胞(鞭毛的宽度小于蓝光的波长)附着在一起并不会产生任何阴影。这要么需要详细说明,要么需要删除。

11) 图1-图补充3:仅显示凝集素印迹的一半即可。

https://doi.org/10.7554/188bet体育电竞eLife.58805.sa1

作者的反应

而审查员也认为N-糖基化模式影响细胞粘附水平,可能是一个有趣的结果,值得在eLife上报道,他们也指出了主要的弱点,并提出了严重关切的有效性的结论,在该领域的研究进展的手稿。188bet体育电竞具体地说,关键的AFM和微管实验,虽然非常优雅和巨大的潜力,如之前的出版物所示,是在药物存在的情况下进行的,这似乎会杀死和破坏许多细胞。糖基化的改变是否直接影响粘连或改变蛋白折叠或纤毛蛋白组成尚不清楚。此外,突变并没有消除n -糖基化,但改变了组成和大小,这提出了这些变化如何干扰粘附的问题,考虑到双突变体在抗hrp染色中显示了微妙的变化。因此,专家组建议,目前形式的研究工作还太初级,不能考虑在eLife上发表,手稿可能会因重大修订而受益匪浅。188bet体育电竞以下列出的要点为如何改进手稿提供了明确的指导。

HRP印迹已经重复,显示WT和N糖基化突变体。此外,刀豆蛋白A亲和蛋白印迹已经完成,说明刀豆蛋白A对所有人都有更高的亲和力N-糖基化突变体,支持改变N质谱已经观察到,所有突变体的-糖成熟与WT相比。免疫荧光图像进一步以简化的方法重复,以便更好地理解。为了解决通过两种不同方法(AFM和微吸管力测量)测量粘附力的可比性这一重要问题,在微吸管方法中使用纤毛蛋白酶D也对粘附力进行了评估。最后,我们提出的实验证据,纤毛霉素D作用于动力蛋白,并测量的力量不是由其假定的毒性造成的。为此,在双突变体IM中引入了细胞质动力蛋白的温度敏感突变Man1AXIMXylT1A因此,根据审稿人的建议,在允许和限制温度下,通过AFM测量了该突变体的粘附力。

必要的修正:

1)从图4A和图3C中可以看出,对照和xylT1A突变体的“粘附力”差异是不同的,这可能是由于方法的不同。然而,由于使用了不同的菌株,也有可能在粘附表型上存在很大的菌株特异性差异(使用了两个不同的野生型菌株),这并不一定与感兴趣的突变有关。由于没有提出挽救实验,基因型和相当可变的表型之间的相关性有点不确定。

事实上,所测的附着力具有应变特定的分量。这是一个有趣的发现,但超出了我们手稿的范围。为了进一步支持纤毛酶D影响所测粘附力的发现,并允许对两种用于测定粘附力的方法进行更好的比较,此外,还在AFM测量中使用纤毛蛋白D进行微管力测量(新图4)。这些测量证实纤毛蛋白D的效果可以在两种测量中观察到。因此,独立于野生型遗传背景和粘附力测定类型,我们观察到N-糖基化成分影响表面粘附。在我们看来,这巩固了我们结果的稳健性(尽管有各种不同的方法),甚至加强了我们发现的普遍性。

2)抗hrp双突变体鞭毛提取物染色得到的图案与野生型鞭毛十分相似。这与双突变体中黏附力受影响最大的观察结果如何?关于蛋白糖基化,双突变体比两个单突变体更好(例如,单突变体抗hrp结合减少,双突变体抗hrp结合恢复正常),但没有解释为什么会这样。Schulze等人指出,甘露糖苷酶的缺失抑制了XlyT1A突变,但是——因为它被称为敲下突变——Man1A突变似乎不是null?

到目前为止,我们还没有分子上的知识来了解改变是如何发生的N-糖基化作用影响表面黏附,即N-糖基化的蛋白质N-聚糖成分对“wt样”作用至关重要。在未来的研究中,这个问题将会非常有趣。为了避免广泛的,没有数据支持的推测,我们省略了关于为什么双突变体最受影响的讨论。我们发现我们在之前的手稿版本中没有足够清楚地说明这一点,现在在修订版中包括了相应的段落。此外,为了清楚地表明,在这份手稿中分析的所有突变体都显示出它们的具体变化N-聚糖模式,HRP-blot重复,并进行刀豆蛋白a亲和蛋白印迹。HRP-blot现在清楚地显示HRP在两种IM中的结合增加Man1A和双突变体以及在IM中减少的结合XylT1A此外,Con-A亲和印迹显示,Con-A在分析的所有突变体中都有更高的亲和力(图1 -图补充3)。这些结果现在清楚地提供了证据,也表明双突变体发生了改变N-多糖成熟,而不是关于N糖基化。

3)观察到Ciliobrevin D(一种IFT动力蛋白抑制剂)处理增加了粘附力。然而,如材料和方法部分所述,纤毛霉素d处理细胞时,许多细胞死亡。因此,这里所观察到的效果是否真的是由于动力蛋白的抑制,还是由于药物的某些毒性,尚不清楚。

很抱歉,我们之前的原稿措辞不清楚,造成了误解。在制备过程中,我们没有观察到该药物(纤毛霉素D)的任何毒性作用。我们这一技术评论的目的是强调在制备过程中离心分离活细胞和死细胞或爆裂性细胞的作用。移液管只吸取游动细胞,本实验只使用处理过的细胞悬液的上部(约15 mL)。实验过程中,液腔内未见死亡细胞。观察到的效果确实与动力蛋白的抑制有关。我们对手稿作了相应的修改。

“纤毛霉素D对粘附力的影响表明IFT可能有助于表面粘附力。”但未观察到IFT的差异。那么,作者如何解释纤毛酶的作用呢?主动滑翔是否会降低附着力?

由于纤毛蛋白D被认为可以抑制IFT动力蛋白,该小组建议使用通过温度变化(如fl10ts)来消除IFT的菌株,以进一步探索活性IFT是否会降低细胞粘附。

感谢审稿人的深刻评论。为了排除纤毛蛋白D的毒性,我们产生了三重突变体dynein-1btsXIMMan1AXIMXylT1A42 #(双突变体与动力蛋白1b的CC-4423杂交ts突变体,其中逆行IFT停止,鞭毛在限制性温度下分解)(Engel, Ishikawa et al., 2012)。我们在图5 -图1中添加了这些数据。为了排除鞭毛长度对粘附力的影响,我们比较了dynein-1b测量的粘附力tsXIMMan1AXIMXylT1A42 #在限制性温度下与双突变体IMMan1AXIMXylT1ANaPPi对待。NaPPi的治疗对IFT没有影响(Dentler, 2005)。与纤毛蛋白D存在时的粘附力升高一致,新的三重突变体在限制性温度下显示出更高的粘附力(与NaPPi对照样品相比)。这些结果一方面表明,纤毛蛋白D存在时评估的效果不归因于毒性,另一方面,它表明活性动力蛋白1b降低了鞭毛的粘附力(见图5 -图补充1)。当然,这是一个有趣的发现,开启了一系列未来需要回答的问题,然而,表明IFT或动力蛋白1-b究竟如何参与粘附并不是本手稿的意图,而是集中在糖基化是否影响粘附的问题。

作者应该讨论这些约束措施的性质和相关性。在现实生活中,这种生物体的自然表面是什么?当聚苯乙烯(珠子),玻璃(AFM)和硅(微管)呈现出所有相似的表面电荷时,在这项工作中报告了什么样的相互作用?为糖与表面之间的相互作用提供一个合理的描述将是有用的。

我们一致认为,精确地分析两者之间的相互作用是非常有趣的N多糖和表面。正如Kreis et al., 2019所述,鞭毛介导的粘附在很大程度上独立于底物属性。因此,目前还无法确定本研究中观察到的聚糖与表面之间的相互作用。关于这个问题的发言纯属推测。

手稿复杂,难以阅读,作者可以更好地解释他们的一些实验背后的逻辑。为了引导读者通过众多的变化,一些细节应该更明确地列出。特别地,讨论的最后一部分,关于纤毛蛋白D的影响及其与滑翔的联系,可能可以更清楚地解释和进一步讨论。一些细节目前还没有给出一个清晰的概述。

谢谢。手稿被重写以使内容更全面。

[编者注:在接受之前建议进一步修订,如下所述。]

修正:

1)“减少N-聚糖的复杂性阻碍了鞭毛与表面结合所需的粘附力,正如力光谱学所证明的那样,并损害聚苯乙烯珠的结合和运输。”

在这句话的开头解释使用的方法时,删除“如力谱所示”。重要的是要澄清“……减少。N-糖基化降低鞭毛的粘附力。这导致珠子的运动性降低,但细胞在固体表面不能滑动。”

谢谢你的便条。我们删除了这句话中建议的部分,以避免重复,并将该段订正如下:

“利用原子力显微镜和微管力测量,我们的数据显示,减少N-聚糖的复杂性阻碍了鞭毛与表面结合所需的粘附力。这导致聚苯乙烯珠结合和运输受损,但细胞不能在固体表面滑动。”

2)“由于逆行的运动动力蛋白1b相对于粘附暂停了……”

Shih等人认为,是逆行的IFT序列在粘附位点停留,动力蛋白1b发动机携带这些暂停序列将轴突向相反的方向牵引。

我们已将该段更正如下:

“由于逆行IFT序列相对于粘附位点暂停,而FMG-1B通过其巨大的细胞外碳水化合物结构域与固体表面相连(Bloodgood, 2009),逆行运动蛋白dynein-1b产生的力量将微管推向相反的方向,将细胞体和第二鞭毛拖在后面;滑动过程开始(Shih et al., 2013)。”

3)“考虑到N-糖蛋白本身对粘附是重要的,但经常从鞭毛膜丢失,滑行需要大量的能量,这表明鞭毛介导的粘附具有某种高度的重要性。此外,它还提出了一个问题,是否成熟的N-聚糖(作为额外的能量消耗)在鞭毛介导的粘附中是重要的,即是否N-糖基化对粘附至关重要,而不是糖蛋白的正常折叠。”

关于ATP成本的推理相当抽象,也不相关。这一部分应该从手稿中删除。相反,作者可以在引言中指出衣藻物种通常生长在固体表面(然后可能通过滑动移动)由于许多衣藻物种可以生活在各种各样的表面(土壤、沙子、湿叶、苔藓和树皮),鞭毛表面粘附系统没有发展出高度的特异性,而是具有很大的灵活性。

我们对该段进行了修改,在引言部分增加了建议:

"由于天气炎热,NFMG1-B的鞭毛外结构域-糖基化水平,与固体表面相互作用,提示N-糖基化可能是粘附的关键,而不是糖蛋白的正常折叠。”

“这些发现表明,粘连系统c . reinhardtii与微藻生活在自然界的固体表面的高度多样性相一致,从土壤和沙子到潮湿的叶子、苔藓和树皮(Harris, 2009),已经发展为极大的灵活性而不是高特异性。”

4)研究了两个插入突变体IMMan1A、IMXylT1A及其双突变体IMMan1AxIMXylT1A。

此处将IM定义为插入突变体。

缩写词现在已在文本中定义。

5)“n -聚糖成熟的改变并不影响FMG-1B的鞭毛定位。”

作者应引用Bloodgood, Salomonsky and Reinhart, 1987,本文图5与原稿图1结果相同。本文还报道了糖基化缺陷FMG-1B突变体与刀豆蛋白A的结合增加。

谢谢你的便条。我们同意并增加了各自的参考和讨论:

“这与Bloodgood等人的早期发现一致,他们报道了在aN-糖基化突变体L23显示增加的cona亲和力(Bloodgood et al., 1987)。

6) “由于不能排除温度变化引起的鞭毛缩短(图5-图补遗1D)影响鞭毛粘附力,AFM将用20 mM NaPPi处理的三重突变体作为对照进行评估。”

目前还不清楚为什么使用NaPPi治疗作为对照。因为不能排除鞭毛缩短?黏附力是否与鞭毛长度有关?

由于我们没有关注鞭毛长度的差异是否影响鞭毛粘附力的问题,因此没有进行这类实验。然而,由于我们不能排除可能存在依赖关系,我们决定通过AFM分析类似鞭毛长度约6.5 μm的细胞。因此,我们使用NaPPi在非限制性温度下(处理20分钟后)将牛肚突变体的鞭毛缩短至6.5 μm,这与三重突变体在限制性温度下观察到的长度相同。这一点现在已经在手稿和人物传说中得到了澄清。

7)“可以推测,dynein-1b的作用降低了鞭毛粘附力,因为它的作用方向与鞭毛粘附力相反。”

目前尚不清楚作者所说的“相反的行动方向”是什么意思。这是否意味着IFT动力蛋白将膜从底物上拉离?或者,在暂停的IFT列车上,动力蛋白马达产生的力会将FMG1B簇从表面分离出来,有效地降低鞭毛的粘附力吗?

我们显然不知道动力蛋白1b的作用为何以及如何导致粘结力的增加。我们认为这是由于动力蛋白1b的运动破坏了粘附蛋白簇的稳定性,从而降低了动力蛋白1b活性时的粘附力。我们已经修改了各自的段落,希望能更清楚地展示我们的假设。

8)“值得注意的是,FMG-1A也定位于鞭毛(但是),它的丰度在WT和营养细胞中的突变体之间没有改变(图1 -图补充4)。”

这里还不清楚结论是什么。

事实上,我们没有在引用的字句中充分表达我们的意图。到目前为止,关于FMG-1A的作用知之甚少,通常只被称为FMG-1的次要(不重要)形式。有人认为它主要在生殖细胞中表达。然而,在我们的质谱数据中,FMG1-A在营养细胞的鞭毛中也非常丰富,这表明它可能比目前认为的更重要。

我们将该段修改如下:

“值得注意的是,FMG-1A也定位于鞭毛,它的丰度在WT和营养细胞中的突变体之间没有改变(图1 -图补充4)。这与目前认为FMG-1A仅在生殖细胞中表达的假设形成了对比,并开启了它是否可能与FMG-1B有类似的作用的问题,考虑到这两种蛋白质的高度相似性(Bloodgood, 2009)。

9) “我们的数据进一步表明鞭毛装配……”。

作者应该更清楚地说明,n -糖基化对鞭毛伸长、IFT和FMG-1B不需要,但鞭毛表面与固体底物的粘附需要n -糖基化,n -糖基化突变体的粘附力减弱仍然足以进行滑翔。我们建议删除“这表明粘附的进化可能不仅仅是由滑翔能力决定的,而是由粘附本身的必要性决定的。”

我们已经执行了建议的删除,并将该段修改如下:

“我们的数据进一步表明,鞭毛组装、IFT和FMG-1B运输到鞭毛不受影响N-糖基化作用不涉及N-糖基化。相反的,适当的N鞭毛蛋白的-糖基化对粘附至关重要c . reinhardtii细胞表面。我们的观察进一步表明,尽管在N-聚糖突变体,仍然足以滑翔。”

10) “鉴于鞭毛粘附对蓝光的反应,它可能将粘附与蓝光介导的光保护联系起来,因为粘附可能通过细胞阴影产生光保护。”

作者在这里用阴影表示的意思尚不清楚。仅仅因为一个细胞(鞭毛的宽度小于蓝光的波长)附着在一起并不会产生任何阴影。这要么需要详细说明,要么需要删除。

我们同意我们的想法表述得不够清楚。我们的假设是对蓝光的反应c . reinhardtii可能通过附着在表面形成多层生物膜。这种生物膜可能因此允许相互的细胞遮荫导致光保护。这一点现在已在手稿中澄清如下:

“考虑到鞭毛粘附对蓝光的反应,它可能会将粘附与光保护联系起来,这也是蓝光介导的,因为粘附可能会通过生物膜的形成产生光保护,而这反过来会使细胞相互遮荫。”

11) 图1-图补充3:仅显示凝集素印迹的一半即可。

已经按照建议修改了这个数字。

https://doi.org/10.7554/188bet体育电竞eLife.58805.sa2

文章和作者信息

作者详细信息

  1. 小南南徐

    1. 中国科学院武汉水生生物研究所,中国科学院藻类生物学重点实验室
    2. 中国科学院大学,北京
    贡献
    调查,写作-审查和编辑
    了同样的
    安妮·奥尔特曼斯
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
    ORCID图标 "此ORCID iD标识本文作者:"0000-0003-2847-7225
  2. 安妮·奥尔特曼斯

    Münster大学植物生物学与生物技术研究所,Münster,德国
    贡献
    形式分析,调查,写作-初稿
    了同样的
    小南南徐
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
    ORCID图标 "此ORCID iD标识本文作者:"0000 - 0002 - 0153 - 048 - x
  3. 龙胜赵

    1. 英国利物浦利物浦大学综合生物学研究所
    2. 山东大学微生物技术国家重点实验室,海洋生物技术研究中心,青岛
    贡献
    调查
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
  4. 安东尼Girot

    马普动力学和自组织研究所(MPIDS), Göttingen,德国
    贡献
    调查
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
  5. 马尔基·卡里

    马普动力学和自组织研究所(MPIDS), Göttingen,德国
    贡献
    调查
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
  6. 劳拉Hoepfner

    Münster大学植物生物学与生物技术研究所,Münster,德国
    贡献
    调查,写作-审查和编辑
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
    ORCID图标 "此ORCID iD标识本文作者:"0000-0002-8222-4563
  7. 西蒙Kelterborn

    柏林洪堡大学生物实验生物物理研究所,柏林,德国
    贡献
    调查
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
  8. 马丁朔尔茨

    Münster大学植物生物学与生物技术研究所,Münster,德国
    贡献
    形式分析
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
  9. 茱莉亚贝ß厄尔

    Münster大学植物生物学与生物技术研究所,Münster,德国
    贡献
    正式的分析、调查
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
  10. 彼得·赫格曼

    柏林洪堡大学生物实验生物物理研究所,柏林,德国
    贡献
    监督,写作-审查和编辑
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
    ORCID图标 "此ORCID iD标识本文作者:"0000-0003-3589-6452
  11. 奥利弗Baumchen

    1. 马普动力学和自组织研究所(MPIDS), Göttingen,德国
    2. 实验物理V,拜罗伊特大学,德国
    贡献
    资金的获取,验证,写作-审查和编辑
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
    ORCID图标 "此ORCID iD标识本文作者:"0000-0002-4879-0369
  12. Lu-Ning刘

    1. 英国利物浦利物浦大学综合生物学研究所
    2. 中国海洋大学海洋生命科学学院,深海多圈层与地球系统前沿科学中心,青岛
    贡献
    监督、资金获取、写作-审查和编辑
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
    ORCID图标 "此ORCID iD标识本文作者:"0000-0002-8884-4819
  13. Kaiyao黄

    中国科学院武汉水生生物研究所,中国科学院藻类生物学重点实验室
    贡献
    概念化,监督,资金获取,项目管理,写作-审查和编辑
    为对应
    huangky@ihb.ac.cn
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
    ORCID图标 "此ORCID iD标识本文作者:"0000-0001-8669-1065
  14. 迈克尔hipple说道

    1. Münster大学植物生物学与生物技术研究所,Münster,德国
    2. 日本仓石冈山大学植物科学与资源研究所
    贡献
    概念化,监督,资金获取,项目管理,写作-审查和编辑
    为对应
    mhippler@uni-muenster.de
    相互竞争的利益
    没有宣布相互竞争的利益
    ORCID图标 "此ORCID iD标识本文作者:"0000-0001-9670-6101

资金

德意志Forschungsgemeinschaft (HI737/12-1)

  • 迈克尔hipple说道

国家自然科学基金(31671399)

  • Kaiyao黄

皇家学会(UF120411)

  • Lu-Ning刘

生物技术和生物科学研究理事会(BB/R003890/1)

  • Lu-Ning刘

生物技术和生物科学研究理事会(BB/M012441/1)

  • Lu-Ning刘

皇家学会(URF \ R \ 180030)

  • Lu-Ning刘

皇家学会(EA RGF \ \ 181061)

  • Lu-Ning刘

皇家学会(RGF\EA\180233)

  • Lu-Ning刘

中国博士后科学基金(2019M662335)

  • 龙胜赵

资助方没有参与研究设计、数据收集和解释,也没有决定是否将研究提交出版。

确认

KH实验室的研究得到了国家自然科学基金项目的资助(国家自然科学基金项目31671399号,黄锟),MH得到了德国科学基金项目的资助(DFG, HI739/12-1)。LNL获得了英国皇家学会(UF120411, URF\R\180030, RGF\EA\181061和RGF\EA\180233)和生物技术和生物科学研究理事会(BB/R003890/1, BB/M012441/1)的资助。中国博士后科学基金资助项目(项目编号:: 2019 m662335)。AO和JB感谢S Schulze提供了SugarPy。AG、MK和OB感谢M Lorenz和Göttingen Algae Culture Collection (SAG)提供WT-SAG菌株和R Catalan菌株的技术援助。感谢武汉大学梁志忠、黄建和姜凯教授分享TRIF显微镜。感谢武汉大学谭丹、朱博和薛磊教授分享AFM显微镜和技术援助。

高级编辑

  1. Piali Sengupta, Brandeis大学,美国

检查编辑器

  1. Ahmet Yildiz,加州大学伯克利分校,美国

评论家

  1. 罗伯特红枫叶片
  2. 费利克斯·里科

出版历史

  1. 收稿日期:2020年5月11日
  2. 录用日期:2020年12月9日
  3. 接受的手稿发表:2020年12月10日(版本1)
  4. 出版版本:2020年12月24日(版本2)

版权

©2020,徐等。

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