1. 结构生物学与分子生物物理学
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MIR结构域在蛋白质中的功能意义O.-mannosylation

  1. 安托内拉·基帕里诺
  2. Antonija Grbavac.
  3. 亨德里克·RA琼克
  4. yvonne hackmann.
  5. 索菲亚·莫特森
  6. Ewa Zatorska
  7. 安德里亚Schott
  8. Gunter金牛
  9. 克里希纳Saxena
  10. 克莱曼野生
  11. Harald Schwalbe.
  12. Sabine特拉 是通讯作者
  13. Irmgard犯罪 是通讯作者
  1. 海德堡大学生物化学中心(BZH),德国
  2. 德国海德堡大学有机研究中心
  3. 德国歌德大学生物分子磁共振中心有机化学与化学生物学研究所
研究文章
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引用本文作为:188bet体育电竞网上生活2020; 9:e61189 doi:10.7554 188bet体育电竞/ eLife.61189

抽象的

蛋白质O.- - 炔灭绝转移酶(PMTS)代表了参与S / T富含蛋白质基质的糖基化和展开蛋白的糖基化的保守家族的多盐多链状网状蛋白。PMTS用作二聚体并含有腔MIR结构域,其具有β-三叶折叠折叠,其易于导致人类中的α-染额蛋白化的畸形突变。这里,我们通过使用X射线晶体学和NMR光谱通过综合结构生物学方法分析PMT-MIR域,并评估其在体内PMT函数中的作用。我们确定PMT2和PMT3-MIR结构域结构并鉴定两个保守的甘露糖结合位点,其与一般β-三氟烷烃结合位点(α,β)一致,也是独特的PMT2-亚家族暴露的FKR基序。我们展示了在体内PMT1-PMT2异二聚体的现场α影响的保守残留物。数据将数据集成到PMT1-PMT2结构的上下文中,与同源β-三氟甲醛 - 碳水化合物复合物的比较允许蛋白质中的miR结构域的功能描述O.-mannosylation。

介绍

蛋白质O.PMT家族的-甘露糖基转移酶(PMT)是多跨膜糖基转移酶(GT家族39;http://www.cazy.org),即GT-C褶皱(阿尔伯克基-温特等人,2019年;Bai et al., 2019),催化甘露糖从单磷酸二醇激活甘露糖(dole - p - man)转移到内质网(ER)蛋白质丝氨酸和苏氨酸残基的羟基Neubert和Strahl,2016年).PMT为基础O.-mannosylation是进化保守的,并且重要的过程,在真菌细胞壁完整性和蛋白质质量控​​制键(阿罗约等人,2011年;Gentzsch和坦纳,1996年;徐等人。,2013年).在人类中,这种经典类型的损害O.- Manynynation导致一系列神经肌肉疾病,由于α-制霉甘油糖基化,称为α-染额蛋白化糖基化(审查Endo 2015).

PMTs被分为三个亚家族(PMT1, PMT2和PMT4)Neubert和Strahl,2016年),并且形成内或跨亚家族功能性二聚体(赤坂-马尼亚等人,2006年;吉尔巴赫和斯特拉,2003年;图1A).哺乳动物只有两个PMT蛋白,POMT1和POMT2,用作异二聚体(赤坂-马尼亚等人,2006年).反过来,酿酒酵母有七个不同的PMT家族成员,其中六个已确认具有酶活性(Pmt1-Pmt6)(Gentzsch和坦纳,1997年).PMT4同源体和PMT1-PMT2异二聚体占主要的O.上可溶和膜蛋白质底物-mannosylation活性(Gentzsch和坦纳,1997年;Hutzler等人,2007年).通过形成替代异二聚体的形成,例如PMT1-PMT3和PMT5-PMT2,补偿PMT1或PMT2的功能丧失,进一步解释了PMT蛋白的冗余酿酒酵母吉尔巴赫和斯特拉,2003年).

pmt家族和PMT-MIR结构域的结构。

一种)不同PMT和POMT二聚体的示意图。PMT1(红色),PMT2(橙色)和PMT4(绿色)亚家族与人类同源物一起以各自的颜色给出。在贝克酵母中,PMT1和PMT2亚家族成员形成异源二聚体,Pmt4同源二聚体。没有伴侣是Pmt6的特征。在哺乳动物中,没有Pmt1亚家族。(B.Pmt2-MIR总体结构。颜色编码是根据mir -motif。突出的配体结合位点(α到δ)被突出。(C)PMT3-MIR的结构与PMT2-MIR几乎相同。颜色编码是从N-(蓝色)到C-末端(红色)的斜坡。二次结构在PMT2-MIR中标记和相同。(D.(图a中相同颜色的三个MIR-motif (MIRm1-m3)的叠加。每个MIRm向MIR结构域的保守核心贡献一个色氨酸和一个亮氨酸残基。α/β位点,包括两个保守的组氨酸残基,只存在于MIRm1和MIRm2中。

进入分泌途径的大部分酵母蛋白是O.- MPTS的甲糖苷化(O-MAN),包括通常携带众多细胞壁蛋白的超过90%O.- 甲糖基聚糖(Neubert等人,2016年).O.-Mannosylation PMT的善意底物主要存在于富S/ t蛋白片段(Larsen等人。,2017年;Neubert等人,2016年),而在内质网蛋白质量控制(简称未展开蛋白O.- 甲糖基化;upom)PMTS还靶向孤立的丝氨酸和未折叠蛋白质的苏氨酸(审查徐和NG,2015年).值得注意的是,只有PMT1-PMT2涉及UPOM(Castells-Ballester等人。,2019年;徐和NG,2015年).

尽管PMT为基础的关键作用O.- 多个细胞过程中的甲糖基化,分子特征驱动PMT1-PMT2的基于O.的-mannosylation善意尚未研究upom靶蛋白质底物。只有最近PMT1-PMT2异二聚体的Cryo-EM结构酿酒酵母变得可用(Bai et al., 2019).在这些结构中,每个亚基都有11个跨膜螺旋(TMHs)和两个面向ER管腔(LL)的大亲水性环:TMH1和2之间的环LL1含有催化DE基序(Lommel et al., 2011)和TMH7和8之间的循环LL4,包含所谓的MIR域,其功能仍然未知。

MIR结构域最初是从甘露糖基杂菌酶,肌醇三磷酸受体之间检测到的序列同源物(IP3.和ryanodine受体(RyRs) (2000年桥),不具有保守的蛋白功能(Mackrill,1999).MIR结构域有一个β-三叶折叠,由六个β-发夹组成,以伪三重对称排列。这种折叠最初在白细胞介素-1β和成纤维细胞生长因子(Murzin等人,1992年),但它也存在于许多碳水化合物 - 活性酶(CAZY [Lombard等,2014年),如UDP-GalNAc:负责粘蛋白型蛋白的多肽galnac -转移酶(GalNAc-Ts)O.-glycosylation动物(吉尔等人,2011年).虽然尚未分配,但根据CAZy分类(http://www.cazy.org),MIR结构域β-三氟乳膏将属于碳水化合物结合模块(CBM)折叠家族2(CBM系列13和42;Boraston等人,2004年;Fujimoto,2013;Lombard等,2014年).典型CBM家族13成员是多价糖结合剂,在名为α、β和γ的三角形结构域的每个侧面都包含结合位点(Boraston等人,2004年;Fujimoto,2013).迄今为止对PMT蛋白进行的结构和功能研究并没有回答PMT- mir结构域是否与dole - p - man底物或O-Man肽产品的甘露糖结合,以及它们是否或如何起作用的问题O.- 两者的糖基化善意底物和UPOM靶蛋白。

在这里,我们结合结构生物学和硅分析与体外和体内生物化学来描述PMT-MIR结构域的作用O.两个S / T-丰富的物质和UPOM目标-mannosylation。我们对PMT2-MIR域数据以及它与其他β-三叶草比较确定的PMT-MIR系列的规格,本地化的结合位点的甘露肽产品,并说明在互补的独特PMT2家庭MIR-图案中的作用PMT1,PMT2活性位点。在MIR领域中的重要性O.- 在PMT1-PMT2全酶和相关糖基转移酶的结构的上下文中讨论了 - 甘露出溶解。

结果

PMT-MIR域结构

PMT1和PMT2系列成员(PMT1,PMT5和PMT2,PMT3)的MIR域被表达大肠杆菌和纯化。而PMT1家族的MIR结构域经纳米微分扫描荧光分析证明是不稳定的(nanoDSF,图1 -图补充而PMT2家族MIR结构域则更耐热,更容易形成晶体。利用基质衍生因子2 (SDF2)的MIR结构域进行分子置换,确定x射线结构拟南芥以前在我们的实验室解决(Radzimanowski等人,2010;肖特等人,2010年;图1b,c表格1).PMT2-MIR(1.6埃)和PMT3-MIR(1.9)结构的高分辨率允许详细分析各种结构性能和配体相互作用。PMT2-MIR的X射线结构已经在一个平行的研究中报道,但未分析碳水化合物结合和功能含义(Bai et al., 2019).PMT2家族的MIR结构域显示典型的β-三叶折叠(共12条β-股,PFAM三叶家族CL0066,图1C.;Murzin等人,1992年),包括一个六股的β-桶和一个三角形的β-发夹帽,包括一个发夹三连体。尽管边际序列同源性低于20%,但PMT-MIR结构域在结构上与IP的MIR结构域高度相似3.R和Ryr蛋白(均方根偏差(RMSD)约为1.6埃)(图1-figure补充2a).

表格1
Pmt-MIR结构域的数据收集和细化统计。
PMT2-MIR. Pmt2-MIR(低) PMT3-MIR
数据收集
空间群 P 41 3 2 我21 21 21 P 1
单元尺寸
a, b, c (Å)
α, β, γ(°)

139.6,139.6,139.6
90、90、90

35.4,132.1,132.7
90、90、90

55.3, 64.3, 65.6
107.9, 99.9, 99.7
分辨率(Å) 30.5 - -1.6 (1.66 - -1.6) 93.6–2.3 (2.38–2.3) 52.9 - -1.9 (1.97 - -1.9)
全反射号 579024(54018) 55295(13703) 61932 (5998)
完整性(%) 99.8(100) 95.9(89.2) 95.5(92.3)
CC1 / 2. 99.8(52.7) 96.8 (77.9) 99.9(82.4)
I /Σ(i) 13.45 (1.15) 4.2 (1.4) 14.14(2.22)
R.pim(%) 3.8(58.5) 11.6(43.3) 3.1(36.7)
威尔逊b因子(2 20.8 25.2 27.7
细化
思考数量 61502 (6045) 61926(5997)
R.工作(%) 14.1(25.1) 17.4(30.0)
R.自由(%)* 15.7(33.8) 22.0 (33.7)
不。的原子
 Protein
配体
溶剂
1922
1591
51.
280
6902
6516
18.
368.
蛋白质残留 194 806.
B-factors (2
 Protein
配体
溶剂
31.6
27.7
77.5
45.4
41.0
40.8
49.1.
43.8
均方根偏差
 Bond lengths (Å)
键角(°)

0.014
1.16

0.007
1.13
Ramachandran(%)
青睐
 Allowed
 outliers

95.8
4.2
0.

96.0
4.0
0.
  1. *5%的所有数据。

MIR结构域由三个三叶状的MIR motif单元组成(Bai et al., 2019;肖特等人,2010年),在以下表示Mirm1-3(图1b,d).对于PMT2-MIR氨基酸范围是339-401(MIRm1),402-466(MIRm2)和467-532(MIRm3)(图2).每个MIR-基序包括两个β发夹,一个在枪管和一个在所述帽,以及完成三叶单元发夹管之间延伸的连接(图1D).MIR结构域的疏水核心涉及每个MIR-MOTIF的一个保守的色氨酸和亮氨酸残留物,其中包括在枪管盖界面处的芯的中央三合一布置。鉴于PMT2和PMT3-MIR结构域之间的高序列和结构相似性(68%同一性,RMSD为194Cα-原子的0.7埃),我们进一步分析了PMT2-MIR结构域。

在PMT系列的序列比对。

Pmt1、2和3的MIR结构域的排列是基于结构的。每一条比对线对应一个mir motif, motif本身也进行比对,以突出序列的保守性。上面的编号和二级结构对应Pmt2-MIR。所有mir -motif中疏水性核心的保守亮氨酸和色氨酸残基被连续的灰色条突出显示。α、β、δ位点用彩色框突出显示,δa位点用彩色矩形突出显示。颜色代码是根据图1B..在本研究中突变的残留物被突出显示并用黄色和黑色三角形标记。导致人类病理的残留物被突出显示POMT1和POMT2,并分别用蓝色和红色星号标记。突出显示所有突变的残留物,颜色匹配三角形或星号符号。

Pmt2 MIR结构域包含三个假定的配体结合位点

为了了解PMT-MIR结构域在蛋白质中的作用O.-甘露酰化,我们分析了Pmt2-MIR结构的具体表面性质。在蛋白质表面有两个区域显示出高度的序列保守性(图3A),以下表示为α位点和β位点(残差范围见图2)按照综合CBM术语(Boraston等人,2004年).这些位点定位于帽区明显的表面空洞,在其底部有一对组氨酸。两个腔体都带负电荷(图3B.).的组氨酸是保守的LH的一部分(S / T)H指纹存在于MIRm1链β2和MIRm2链β6(图2).对于PMT2,H362和H364是由一个复杂的氢键模式的严格保守的位点α内固定在一个限定的取向在MIRm1和MIRm3(之间的界面图3C.).MIRm1站点α,这是直接相邻的保守核心的L361,由残基Y380,D384,N386,F504,和Q506形成腔体的壁完成。384 DxNN序列(X,任何残基)是第二突出保守基序,并构成内MIRm1唯一短螺旋(η1)(图2).在MIRm1-MIRm2界面的Pmt2-MIR位点β中发现了几乎相同的排列(图3d).两个空腔通过配体填充存在于结晶溶剂(甘油在现场α[也在PMT3]和硫酸根现场β)。

Pmt2-MIR的表面性质和配体结合位点。

一种PMT家族的表面保护(从青色到白色到紫色的保护增加)。α、β和δa位点对应的是保护度最高的区域,而γ和δ位点则是pmt2特异性位点。(B.)PMT2-MIR的静电表面电位相同的视图(±5K.BT)。虽然位点α和β相当带负电(红色),但部位δ形成带正电荷的贴剂(蓝色)。(C)MIRM1 / MIRM3接口中PMT家族的严格保守的网站α。在部位的腔底部的两个高度协调的组织被连接到甘油配体中,其在其2MF内显示O.dfC电子密度(2σ)。氢键由虚线表示。核心的保守亮氨酸在青色突出显示。(D.)MIRM2 / MIRM1界面中的几乎相同的位点β留下硫酸根离子。(E.)PMT2-MIR-特定部位δ并在MIRm3 PMT保守网站ΔA。站点δ形成高度暴露三叉戟(F516,K517,R518),该坐标的甘油分子,而相邻的站点ΔA是配体游离。平行线表示堆叠。

虽然Pmt2-MIR显示了典型的β三叶褶皱伪三重对称,被归类为C型CBMs (Boraston等人,2004年),类似位点γ(β-三叶中存在的第三个结合位点)在MIRm3中不存在。总的来说,MIRm3在序列上差异最大,核心的关键残基如L492和W524被保存(图2).然而,在β11-β12环的表面上存在,存在双残基插入,其特异于PMT2家族(包括PMT2,PMT3和PMT6)和人焊料(图23E).该循环形式PMT2-MIR的表面露出的配体结合位点,从现在起定义为PMT2家族特异性位点δ。它由F516,K517,R518和,其中仅精氨酸是其他PMT家庭保守的。所述疏水性苯丙氨酸的曝光是特有和指示特定的功能含义的。这三个残基形成已通过氢键拾取另一甘油配体从溶剂,精氨酸侧链和站点内δ骨干酰胺(三叉图3E.).总体而言,MIRm3网站δ显示明显的正表面电势(图3B.).在位置δ附近,另外三个表面暴露残基高度保守(E461, R482, Y491;网站δ)(图23A),形成一个可以与场地δ一起行动的紧密贴片。来自PMT2-MIR与RYR和IP的MIR域的叠加3.R家庭成员(图1-figure补充2b)显而易见的是,位点α至δ不保守,并且MIR系列内的进化相关性仍然模糊不清。

一起服用,我们在PMT2和PMT3-MIR结构域中鉴定了三个推定的配体结合位点。两种miR-motifs形成几乎相同的表面腔,并在所有PMT-MIR中保存,而第三位现场是PMT2家族的MIRM3特异性,并且暴露高度溶剂。

在PMT2-MIR域表示推定的CBM

虽然miR结构域包括β-三轴折叠,其通常被作为CBM折叠家族2(Boraston等人,2004年),尚未报告的任何碳水化合物MIR域的结合。为了表征配体更详细地PMT2-MIR域的结合,我们进行了基于结构的同源性搜索,找到相关的碳水化合物粘合剂。除了PMT,大鹏到SDF2的关系(肖特等人,2010年),在MIR家族中,我们发现许多凝集素与小糖结合型C型CBMs (Boraston等人,2004年).或半乳糖苷酶(PDB ID:1ups,当):其他结构上相关的糖结合β-三叶草中的木聚糖酶(1isv PDB ID)被发现,因此证明一般β-三叶分类作为CAZY数据库的CBMs(Lombard等,2014年).

在所有比较的β-三叶结构,碳水化合物结合几乎完全发生在三角形的顶部区域(发夹三重峰),而不是在β桶(图4A).最重要的是,分析表明,结合模式,以点α和β是高度保守的。然而,第三三叶(MIRm3)内的相应糖结合位点γ中不存在PMT2-MIR,通常并不将PMT家族成员中的保守(图2).在Pmt2-MIR位点发现的配体α和β匹配比较结构中的糖部分(图4B和C).cbm -碳水化合物相互作用的一般主题(Boraston等人,2004年),是糖环(PMT2-MIR中的甘油)填充溶剂暴露的芳族残基(在PMT2-MIRM1中的Y380),而羟基 - 基团在糖结合腔底部的极性残留物键合(PMT2-MIRM1中的H362)。

MIR结构域作为碳水化合物结合模块(CBM)。

一种)的PMT2-MIR域被示出为仅根据相应MIRm着色的三角形盖内的β链。结合到α,β的碳水化合物部分,和在β-三叶CBM结构γ位点重叠并示出连同结合到PMT2-MIR位点的配位体α〜δ(红色)。每个配体结合位点定位于三角形的一个侧表面上。(B.)位点α对应于一般碳水化合物结合位点,并呈现保守的芳族和极性残留物。(Cβ位点虽然与α位点非常相似,但碳水化合物配体所占比例较低。

综上所述,基于结构的同源性证明了Pmt2-MIR配体结合到一般β-三叶草碳水化合物结合位点α和β的可行性,表明其与供体或受体底物甘露糖部分相互作用。

Pmt2-MIR结构域与O-Man肽配体相互作用

为了表征PMT2-MIR的配体结合容量和特异性,我们通过酶反应的两个底物和产物进行了NMR相互作用研究。同位素标记(15.n和13.C,15.N)产生Pmt2-MIR。采用三维三共振实验结合选择性15.氨基酸的n标记(图5-Figure补充1),通过核磁共振筛选和滴定实验,超过一半(56%)的主链酰胺共振可以从结构上描绘出与甘露糖及其衍生物的相互作用。α-甘露糖-1-磷酸(α-甘露糖-1-磷酸图5-Figure补充2).没有任何测试的糖(葡萄糖,葡萄糖-1-磷酸盐,葡萄糖-6-磷酸,甲基-α-葡糖苷,甘露糖苷-6-磷酸和甲基-β-甘糖苷)甚至以10mm的浓度显示出显着的CSP。

确定的相互作用面包含两个空间紧密的区域,分别属于Pmt2-MIRm1和-MIRm2 (图5-figure补充3).相互作用时最大的CSP与甘露糖和周围的PMT2-MIRm2 453-DNKD基序(D453和D456显示最大的CSP),其对应于位点β观察。小但显著的CSP也在PMT2-MIRm1(S359,L360,L361,R395,和G396)及其周围附近(S422,T495,F504和)指示的网站的α中的相互作用的附加参与观察。

在这些结果之后,进行NMR滴定实验以监测PMT2-MIR是否结合O-MAN受体肽(Bausewein等,2016年;Weston等,1993年).没有明显的变化1H,15.在添加8倍以上的未修饰多肽(YATAV和CYATAV)后观察到n相关谱,表明它们不相互作用(图5 b).相比之下,在添加O-Man多肽(YAT(O-Man)AV和CYAT(O-Man)AV)后,信号和CSPs的清晰出现和消失,这已经在Pmt2-MIR:肽比例为1:1的情况下可见,表明在中间到快速交换NMR时间轴上存在相互作用。与甘露糖相比,Pmt2对O-Man多肽的亲和力要强得多。Pmt2-MIR晶体结构上的O-Man肽结合图谱显示,与甘露糖相同的两个区域参与其中,尽管程度不同。在α位点附近观察到显示最大CSPs(慢交换)的主链酰胺。图5a,b),表明这是识别O-Man肽的主要区域。有趣的是,在与甘露糖以及O-Man肽相互作用时,MIRm1和MIRm2(分别为L361和L427)结构域中两个高度保守的亮氨酸残基的主链酰胺表现出明显的CSPs,而MIRm3 (L492)中的亮氨酸则没有表现出任何明显的扰动。即使亮氨酸侧链位于蛋白质的核心,主酰胺感知(间接)对甘露糖和O-Man多肽相互作用的影响。

对PMT2-miR的O-MAN肽结合的表征。

A、B)NMR分析。(一种)使用AV肽(NMR滴定实验PMT2-MIR的相互作用与YAT(O-MAN)1H15.N-HSQC光谱,左)。消失和新出现的信号和明显的化学换肤扰动(CSP)表明O-MAN肽的结合。将最扰动的酰胺交叉峰映射到X射线晶体结构(右)上,显示主要来自MIRM1和MIRM2的两个(保守)区域涉及(对应于位点α(在持续的红色圆圈)和β(在持续的蓝圈中))albeit to a different extent. Interestingly, the backbone amides of some conserved leucine residues buried within the interior of the protein are also affected upon the interaction, hinting at indirect effects such as conformational changes within the protein upon substrate binding. (B.Pmt2-MIR与O-Man和未修饰肽的相互作用。Pmt2-MIR与O-Man和未修饰肽相互作用的CSPs从NMR滴定系列中获得(1H15.的N- HSQC谱在PMT2-MIR测量:1的肽的比率:0(APO),1:1,1:2,1:4和1:8)。合并1H15.N酰胺CSPs (ΔδHN =√[(ΔδH))2+(0.1×ΔδN)2], 在1H ppm)在Pmt2序列上的图谱显示,未修饰的肽段无显著变化,O-Man肽段(YAT(O-Man)AV和CYAT(O-Man)AV)有明显的CSPs。用CYAT(O-Man)AV肽Pmt2-MIR滴定观察到酰胺信号强度的总体下降(G447,用星号标记,因为它消失了,所以不能在光谱中追踪)。(C)与Pmt2-MIR结合肽底物/产物的MST分析。通过分析YATAV肽及其O-Man产物YAT(O-Man)AV对Pmt2-MIR及其位点α突变体(H362.一个H364.一个)。

基于这些结果,该O形曼肽CYAT的结合(O-MAN)AV到PMT1家族成员PMT5通过使用1D NMR滴定相比PMT2-MIR的MIR域1H光谱。两个MIR结构域向O-MAN肽显示出不同的相互作用曲线,其指示明显的NMR时间尺寸。虽然PMT2-MIR在中间时间尺度上强烈绑定(信号扩大和消失;图5-Figure补充4A), Pmt5-MIR在慢交换(分别为自由和结合形式消失和新出现的信号;图5 - 数字补充4B).这些数据表明,不同家庭的MIR结构域表现出不同的亲和力或特异性,并且可能在不同的动力学时间内运行。

连胜,NMR数据定位PMT2-MIR(对应于位点α和β)内的两个相邻区域与甘露糖和O-MAN肽的相互作用有关。此外,PMT5-MIR还结合O-MAN肽,但在不同的NMR时间尺度上,这可能与MIR域中的特异性,活动和相互作用相关的蛋白质O.-mannosylation。

PMT2-MIR现场α喜欢甘露肽

为了测试Pmt2-MIR α位点是否为甘露醇化肽产物的结合位点,并量化结合亲和力,我们进行了微尺度热电泳(MST)测量(Seidel等人,2013年).这种方法使我们能够确定解离常数(KD.用于荧光标记的PMT2-miR和Yatav或Yat(O-MAN)AV肽的值,以便比较甘露基化反应的基材或产物的亲和力(图5 c).荧光信号以100nm的典型浓度为标记的PMT2-miR的测量能力,以及从高纳摩尔到低毫摩尔浓度的配体浓度。对于未修饰的肽,MST测量在低毫米范围内产生弱结合亲和力(K.D.的2.8±0.4毫米),而大约7倍强(400±55μMO形曼肽结合),这表明PMT2-MIR参与产品结合,而不是在底物识别。来缩小在糖识别的相互作用位点和对挑战现场α,在推定的糖结合口袋的底部的两个保守的组氨酸(H362,H364)突变为丙氨酸。执行MST分析用相同的参数设置的节目在亲和力的三倍减少为O形曼肽(1.2±0.3毫米)(图5 c).在未修饰的肽上的首选结合可以通过上述位置α上的空腔壁(例如Y380)来解释。有趣的是,尽管携带组氨酸双突变的Pmt2的总体蛋白丰度在体内未受到明显影响(图7 - 数字补充1A),重组PMT2-miR2的纳米粉末测量(图1 -图补充)表明突变也会导致域稳定化。

总的来说,肽结合数据与比较结构分析和核磁共振数据的预测一致,表明Pmt2-MIR位点α是O-Man肽产物的首选结合位点。

Pmt2-MIRm1 α位点与galna - t2凝集素结构域的相似之处

Galnac-TS是有效蛋白质O-糖基化所必需的催化和凝集素结构域之间的动态相互作用的主要示例(里拉-纳瓦雷特等人,2015年).的凝集素样β-三叶草的一般功能被认为是局部的底物浓度为有效催化和S / T-丰富的多的受体底物的编排(调制杜邦等人,1998年;藤本等人,2002;Thobhani等人,2003年).galna - t2的结构(里拉-纳瓦雷特等人,2015年;里拉-纳瓦雷特等人,2014)中发现了两个GalNAc基团,一个位于凝集素结构域的活性中心,另一个位于α位点,与两个苏氨酸残基结合,间隔为9个残基(图6A).按照我们的结构分析中,所述糖肽的凝集素结构域的结合模式可能作为由PMT2-MIR现场α识别一个O形曼肽的第一模型(图6B.).此外,当我们比较galna - t2结构与Pmt1-Pmt2低温电镜重建(Bai et al., 2019),活性中心和α是合适的β三叶形位点之间的距离,以适应与类似间距糖的糖肽(图6 c).

在PMT2和的GalNAc-T2β-三叶草的类比。

一种)人类GalNAc-transferase 2(粉色)与galnac -糖肽(PDB-ID 5ajo)结合的活性中心(AC)和凝集素域α位点的空间相关性[里拉-纳瓦雷特等人,2015年])。两个位点被附接至苏氨酸T3和糖肽(青色)的T13的GalNAc部分(黄色)分别占据,。该网站距离由一个红色箭头表示。(B.)PMT2-MIRM1位点α(蓝色)与人Galnac-T2的凝集素结构域叠加。PMT2-MIRM1位点α内的甘油(红色)与糖肽的GalNAc部分重叠。(C) Pmt1-Pmt2复合体中AC在Pmt2-TMD中相对于Pmt2-MIR α位点的空间排列(PDB-ID 6p25 [Bai et al., 2019])。Pmt2-TMD与pytv肽结合,Pmt2-MIR α位点被甘油占据,在Pmt2-MIR x射线结构中发现(红色,用星号表示重叠)。位点距离与GalNAc-T2相似。

将PMT-MIR结构域与Galnac-T2凝集素结构域的类比一起提出类似的结合模式和β-三叶草在调节局部底物浓度中的β-三叶剂的功能,以便有效地催化O-糖基化。

探测体内PMT2-miR配体结合位点的功能

我们进一步测试了PMT2-miR配体结合位点的功能重要性,通过丙氨酸在MIRM1位点α(H362,H364 H362,H364)中分配了碳水化合物结合的特征中的组氨酸残基的丙氨酸中的PMT2活性的PMT2活性的功能重要性。(H362,H364)和Mirm2位点β(H428,H430)以及现场δ(F516,K517)中的PMT2-亚家谱的MIRM3 FKR基序。与野生型PMT2相比,所有PMT2突变蛋白在总膜上同样丰富,表明全长PMT2的稳定性不受各自的氨基酸取代的影响(图7 - 数字补充1A).评估PMT2-MIR突变对体内PMT1-PMT2复合物的Mannosyl转移酶活性的影响,O.典型富含S/ t的Pmt1-Pmt2底物的-甘露酰化状态(细胞外热休克蛋白Hsp150 [罗素等人,1993年]细胞壁蛋白质SCW4 [卡佩拉罗等人,1998年[Western Blotting分析])分析。减少O.-如前所述,缺少Pmt2时的甘露糖基化通过靶蛋白向较低分子量的转移来指示(Gentzsch和坦纳,1997年;Grbavac等人。,2017年).在检测的突变体中,只有MIRm1位点α (H362.一个H364.受影响的[PMT2-2HIS-α]O.- HSP150和SCW4的甲醛化(图7).

Pmt2-MIR在体内的功能表征。

得了)表达载体对照(YEp352;空向量;EV)或ha表位标记的野生型Pmt2 (pVG80)或其α位点丙氨酸替换的突变体(2His-α: H362.一个H364.β位点(2His-β: H428一个H430A(PAG2))和组合(4His-α/β:H362.一个H364.一个H428一个H430A(PAG4))以及站点δ(f516A(PAG7);K.517(pAG8);颗-δ:F516一个K517A(PAG9))。(一种O.典型PMT1-PMT2的-mannosylation状态衬底Hsp150(上图)和Scw4(下图)。表明构建的表达PMT2Δ突变体表达ha标记的Hsp150(菌株AGY15,上图)或Scw4(菌株AGY15,上图)PMT2δ用Yep351a,下面板转化。HSP150和SCW4被蛋白质印迹分析,详见了材料和方法。分子量标记显示在右侧。(B.的)分析O.通过FACS(上图)和Western印迹(下图)的UPOM基板ER-GFP的-mannosylation状态。(; WT BY4741)或指示的构建体野生型菌株中表达PMT2δ突变体(Y00386)。上图:显示菌株的荧光强度,表明O.-mannosylation ER-GFP。以WT菌株的平均荧光强度值为参考,设为1。采用显著性水平p<0,05(*)的t检验进行统计学分析。缩写ns代表不显著。下图:ER-GFP的糖基化变体可见(黑色和白色箭头)先前已描述(Castells-Ballester等人。,2019年).(C温敏表型的互补pmt2pmt4突变体转化的与所指示的构建体。菌株的热敏性被接种通过在30℃和35℃进行比较酵母生长后评估45小时。十倍连续稀释,从10日开始6.,在下面的面板中显示。

此外O.S / T-富基板-mannosylation中,PMT1-PMT2复合物也已知作用于体现或错误折叠的蛋白质,其通常不目标O.-mannosylation,即称为UPOM过程(综述Neubert和Strahl,2016年).探讨PMT2-MIR网站的组氨酸突变的影响α和βUPOM,我们采取了ER-GFP,其经历的优势O.-mannosylation通过PMT1-PMT2在ER中,由于其慢折叠动力学。O.-甘露聚糖干扰荧光团的适当折叠,导致荧光强度降低,使该蛋白成为监测UPOM效率的优秀报告蛋白(Castells-Ballester等人。,2019年;徐等人。,2013年).有趣的是,各自的组氨酸取代(Pmt2-4His-α/β)不受影响O.ER-GFP的-mannosylation由Western印迹显示(图7 b,较低的面板和图7-Figure补充1B)和ER-GFP高度相似的荧光强度(图7 b在表达野生型和突变PMT2版本的菌株中的上图。

PMT2家族特异性FKR基序的丙氨酸突变(FK- δ: F516一个K517A)不影响O.- 典型PMT1-PMT2靶蛋白(HSP150和SCW4;图7)和upom目标ER-GFP(图7 b).然而,K517突变蛋白不能完全补充突变体的温度敏感性pmt2pmt4图7 c)提示对Pmt2功能有轻微但显著的影响。在PMT2-MIR α和β位点和384-DxNN motif中观察到类似的表型(图7-Figure补充1C).

综上所述,我们的体内实验数据表明,PMT2-MIRm1位点α中的组氨酸尤其重要O.- 富含S / T的基材的糖基化,但在ER蛋白质质量控​​制期间不适用于非规范蛋白质基质。

讨论

在本研究中,我们推导了一个一般的工作模型O.通过在全长PMT1-PMT2蛋白质复合物的上下文中PMT-MIR域-mannosylation。酵母PMT1,PMT2异二聚体近期冷冻电镜结构(Bai et al., 2019)并没有赋予MIR结构域一个功能,这就留下了它们是否或如何参与PMT催化机制调控的问题。我们分析了Pmt2-和Pmt3-MIR结构域的高分辨率x射线结构,发现在三角帽区域的每一侧都有特定的配体结合位点(α, β, δ)。一般来说,虽然β-三叶草褶皱是一个专用的煤层气(Boraston等人,2004年;Fujimoto,2013), PMT-MIRs与碳水化合物的结合尚未被研究。其他PMT-MIR结构域和碳水化合物结合β三叶结构域的α和β位点的序列和结构保守促使我们对甘露糖衍生物和O-Man多肽的结合倾向进行了深入研究。核磁共振研究表明Pmt2-MIR确实是一种CBM,两个相邻区域特异性地参与了甘露糖、α-甘露糖-1-磷酸和O-Man肽的特定相互作用。甘露糖与MIRm2 β位点的相互作用较弱,而O-Man多肽与α位点周围的MIRm1的结合更强。此外,PMT1家族Pmt5-MIR与O-Man多肽的不同相互作用可能与PMT家族的动态相互作用和不同特异性有关。

完整的Pmt1-Pmt2低温电镜结构(Bai et al., 2019)揭示了与PMT1-MIR触摸PMT2次跨膜结构域(TMD)和PMT2-MIR不形成任何叔胺接触不对称MIR域排列(图8).然而,Pmt1和Pmt2之间的α和β位点的结构是保守的,表明功能一致。我们对Pmt2-MIR的分析表明,这两个位点都能够结合碳水化合物,而MIRm3中各自的位点γ被空间阻断。在低温电镜结构中,Pmt1-MIR γ位点构成了与PMT2-TMD靠近活动中心的界面的主要部分(图8-figure补充1a)及接口由PMT1-MIR域特异性环插入(PMT1 421-SDW)(已完成图2). 引人注目的是,在相反的一侧,这种接触涉及将MIR结构域连接到TMD的环LL4(PMT2 570-PDKF)内的PMT2家族特异性四残基插入(图8形状补充1B). 这种插入是对Pmt2-MIRm3位点δ的补充,暴露了Pmt2家族(Pmt2 F573)中保守的芳香残基,因此我们将其称为位点δ’。当我们将Pmt2 MIR结构叠加在cryo EM结构中的Pmt1 MIR上并交换TMD时,Pmt2 MIR通过相应的接口接触Pmt1 TMD(图8-Figure补充1C).在这样做时,位点δ在空间上对应于LL4插入,并且两个苯丙氨酸匹配恰好。最后,在所有PMT-MIR结构域内的部位ΔA(位点δ)的高保守仍然是神奇的,而是由于其在接近活性位点的位置,它可能涉及底肽识别。包括本研究中识别的新功能的整体PMT1-PMT2几何形状在图8 b.综上所述,MIRm3三叶的pmt特异性界面与活性中心附近的MIR-TMD连接区之间的动力学可能有助于催化作用。

MIR结构域在蛋白质中的功能O.-mannosylation。

一种)酵母PMT1-PMT2复合物的Cryo-EM结构(PDB-ID 6P25 [Bai et al., 2019])。底物肽片段和多酚磷酸(dolichol-phosphate, dole -p)结合在不同的亚基上,MIR结构域方向不对称。配体结合位点和Pmt1和Pmt2活性位点的定位(AC1,AC2)表示。在Pmt2中,甘露糖基化肽从两个ACs到α位点和随后的β位点的推定轨迹用青绿色箭头表示。位点δ(品红,FKR示棒)可能在功能上与Pmt1-MIR相互作用中Pmt2-TMD的位点δ′相对应。(B.)原理模型活跃PMT1,PMT2二聚体和PMT2-MIR合成能力。左:网站δ和互补的δ”居间备用TMD-MIR域相互作用(域动力学表示由双箭头)。网站ΔA可能与基材(青色)进行交互。右:网站α和PMT2-MIR的β结合到甘露糖化肽从而组织PMT1的用于进行性反应活性中心。

催化结构域和碳水化合物结合β-三氟实蛋白之间的动态相互作用不是碳水化合物活性酶的新概念,并且已经在Galnac-Ts中的凝集素样β-三角形(里拉-纳瓦雷特等人,2015年;里拉-纳瓦雷特等人,2014).以下动态交互的理念,我们的PMT2-MIR数据也为所有PMT-MIR域站点α和β保守的特定功能的第一条理由。当我们分析在PMT1,PMT2冷冻电镜结构的情况下我们的数据(Bai et al., 2019)时,PMT2-MIR现场α是等距的位点β和两个活性中心(图8),非常适合将反应产物与间隔约十个残基的改性丝氨酸残基结合。由于PMT二聚体的反应机理尚未阐明,并且无法从静态叠加推断底物轨迹,因此,肽是否由Pmt1或Pmt2中的活性中心进行甘露糖基化仍然难以捉摸。

在这里提供的体内数据补充了结构解释,并提供了驾驶PMT酶学的分子测定剂的首先见解。体内PMT2突变分析表明,位点α仅相关O.-甘露糖基化的S/ t富底物,然而它似乎是必不可少的O.未折叠蛋白靶点的-甘露糖基化。综上所述,这些数据表明pts可以作为一种加工酶,其中高度保守的α位点是催化的关键,最有可能通过结合O-Man产物来确保高效的富含S/ t底物结构域的甘醇化(schematized in)图8 b).MIR结构域的功能是否是使反应产物远离活性中心和/或增加附近未修饰底物丝氨酸和苏氨酸残基的局部浓度仍有待观察。

近年来,一种新的蛋白质-甘露糖基转移酶,由TMTC1-4基因已在Metazoan中鉴定,其在β-鳞片内的β-股内的β-股内的β-股内的β-链中的α-残基(Larsen等人。,2017年).TMTCS(GT系列105)是多杀型跨膜ER蛋白,其具有可变数量的C末端四肽重复(TPRS),其假设对于甘露那糖基转移酶及其蛋白质基材之间的相互作用是重要的(Larsen等人。,2019年).这些酶类似于TMD的数量和拓扑中的PMT,以及某些环区域的氨基酸保守,但它们缺少MIR域(阿尔伯克基-温特等人,2019年).这可能解释TMTC和PMTS的不同底物特异性,进一步指向β-三叶草MIR结构域的重要性,用于S / T富富受体底物的糖基化。

最后,问题仍然是我们的数据是否能够为人类POMT1/2同源基因的突变提供结构和功能上的解释,导致α-糖抗糖病Endo 2015).在POMT1/2中,大多数错义突变位于ER腔侧,其中1/ 3位于MIR域(图2).当映射到PMT2-MIR结构上时,很明显,大多数定位到三角帽区域,尽管可以观察到明显的聚类(图8形状补充2).有迹象表明,直接影响网站的α(Q506在PMT2只有少数突变:Q499.POMT2的R突变[Østergaard等,2018])或部位β(T419,PMT2中的V443:T414M V428D in POMT1 [Bello等人。,2012年;贝尔特兰 - 瓦莱罗去贝尔纳韦等人,2002年]),而没有出现在网站δ或ΔA。有趣的是,大部分的点突变关注非溶剂的暴露参与氢键网络极性残基,并且因此它们的交换可能破坏反射作为这里由nanoDSF测定组氨酸突变的PMT2-MIR现场α内的效果的MIR域。由于α-DG具有粘蛋白型O.-糖基化位点,包含40多个S/T残基(戈麦斯·托莱多等人,2012),我们推导出一种在人体POMT蛋白中,MIR域使用保守机制善意底物O.-甘露糖基化,如这里描述的Pmt1-Pmt2复合物。序列保存表明这些机制在PMT-MIR结构域内被保留。在这种情况下,我们推测Pmt1-和Pmt2- mir结构域与Pmt2-和Pmt1- tmds相互作用并补充各自的活性中心。由于不对称,两个活性中心很可能是依次而不是同时被S/T残基占据的O.-甘露糖基化在受体多肽链内。通过这种方式,Pmt2-MIR结构域保留了新添加的甘露糖,甘露糖基化可以在Pmt2-TMD水平上在其他活性中心进行,反之亦然。这种机制是否也适用于Pmt4同型二聚体仍然是开放的。需要进一步的研究来获得机制细节,例如通过捕获结合供体和受体底物或产物肽复合物中的PMT二聚体,或者挑战这样的设想,并最终获得驱动α-糖醛酸失调的机制的见解。

材料和方法

关键资源表
试剂类型(物种)
或资源
指定 源或引用 身份标识 额外的信息
基因
酿酒酵母
PMT2 酿酒基因组
数据库(SGD)
yal023c.
基因
酿酒酵母
PMT3 SGD. YOR321W
基因
酿酒酵母
PMT5 SGD. YDL093W
基因
酿酒酵母
HSP150 SGD. YJL159W
基因
酿酒酵母
SCW4 SGD. YGR279C
应变,应变的背景
酿酒酵母
BY4741 Brachmann等,1998年 马塔;his3-1;leu2-0;
met15-0;ura3-0
应变,应变的背景
酿酒酵母
Y00385 (pmt2Δ 欧洲 (by4741)yal023c :: kanmx4
应变,应变的背景
大肠杆菌
BL21(DE3) 西格玛奥尔德里奇 CMC0016 电能力的细胞
应变,应变的背景
大肠杆菌
Shuffle T7 Express c3029jvial. 电能力的细胞
抗体 anti-HA
(鼠标,单克隆)
Covance #mms-101r WB(1:10000)
重组DNA试剂 PAG1.
(质粒)
这篇论文 质粒含有pYEP352
骨干和
mPMT2-HA.(H)362.一个H364.一种)
重组DNA试剂 PAG2.
(质粒)
这篇论文 质粒含有pYEP352
骨干和
mPMT2-公顷(H428一个H430一种)
重组DNA试剂 PAG4.
(质粒)
这篇论文 质粒含有pYEP352
骨干和mPMT2-HA.
(H)362.一个H364.一个H428一个H430一种)
重组DNA试剂 PAG9.
(质粒)
这篇论文 质粒含有pYEP352
骨干和
mPMT2-HA.(F)516一个K517一种)
重组DNA试剂 pYEP351a
(质粒)
来自V. MRSA的礼物 质粒含有pYEP351
骨干和
P.Gal1.-SCW4
基于试剂 前向底漆用于
的建设
pAG1和pAG4
这篇论文 PCR引物 AGCTATACAAACTTATCCAGATGG
基于试剂 反向底漆
的建设
pAG1和pAG4
这篇论文 PCR引物 gatgccaatagagatcctcdaag.
基于试剂 前向底漆用于
的建设
PAG2和PAG4
这篇论文 PCR引物 CGCTCCAGTTGCTGCACCAGTG
基于试剂 反向底漆
的建设
PAG2和PAG4
这篇论文 PCR引物 gtagcaagtttttctgcccgtgctttt.
基于试剂 前向底漆用于
建设pAG9
这篇论文 PCR引物 gcaagggacaagaggacctggtgg.
基于试剂 反向底漆
建设pAG9
这篇论文 PCR引物 tgctgggttttttcatgcagacaacctc.
商业测定或套件 Q5 - 网站 - 定向
诱变试剂盒
新英格兰
生物学实验室(内)
E0554S.
重组DNA试剂 pETHis(向量) Bogomolovas等人,2009年
基于试剂 使用前底漆
建设
PMT2-MIR.
这篇论文 PCR引物 GCTTTCCATGGGCCCCC
GTGACATTGCTCT
基于试剂 反向引物使用
建设
PMT2-MIR.
这篇论文 PCR引物 GCTTTGGATCCTTATTCGGG
TCTTGGTGGCAACCTT
基于试剂 使用前底漆
建设
PMT3-MIR
这篇论文 PCR引物 GCTTTCCATGGGACCA
cgtgatgttgctttg.
基于试剂 反向引物使用
建设
PMT3-MIR
这篇论文 PCR引物 GCTTTGGATCCTTTTCT.
CCCTGTGGCAATCTTTCATTTTC
基于试剂 使用前底漆
建设
PMT5-MIR.
这篇论文 PCR引物 GCTTTCCATGGAGACTGT
GGCAGAAGTTGCAG
基于试剂 反向引物使用
建设
PMT5-MIR.
这篇论文 PCR引物 GCTTTCTCGAGTTACTGG.
ATTTGGCAAAGAAATTTCGTT
商业测定或套件 QuikChange 安捷伦科技公司
软件 XDS. XDS包 http://www.xds.mpimf-heidelberg.mpg.de
软件 漫无目的 CCP4套件 http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/harry/pre/aimless.金博宝体育电竞html
软件 傻瓜 笨人 www.mrclmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
软件 菲尼克斯 凤凰套件 https://www.phenix-online.org/
软件 PyMol 薛定谔 http://www.pymol.org.
商业测定或套件 红三-NTA 纳米热 http://www.nanotem-pertech.com.
软件 普罗米修斯NT.48 纳米热 PR.THERMCONTRO. http://www.nanotempertech.com
软件 庞然大物NT.115 纳米热 MO.Affinity分析 http://www.nanotempertech.com
软件 力量Biospin NMR数据采集和处理 https://www.bruker.com
软件 充满活力的加州大学旧金山分校 核磁共振光谱分析 https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/

克隆和表达PMT-MIR结构域的

请求一份详细的协议

使用PMT2-MIR结构域(残留物338-539)使用以区域我和BAMHI限制位点,在pETHis载体中具有可剪切(3C切割位点)或不可剪切n端His6标记的框架内(Bogomolovas等人,2009年).可裂解的结构用于生产用于结晶研究的蛋白,不可裂解的结构用于表达和纯化用于MST实验的蛋白。的Pmt2-MIR-H362.一个H364.使用QuikChange Lightning位点定向突变试剂盒(安捷伦技术)生成突变体。所有结构体均在37℃下表达大肠杆菌T7洗脱菌株并在补充有0.4%(v / v)甘油的标准TB培养基中生长。在od.600时,加入终浓度为1 mM的IPTG,并在22℃下过夜表达。

克隆Pmt3-MIR结构域(残基331-532)以区域我和BAM在PETHIS矢量中,在框架中,在框架中,在框架中,在PETHIS矢量中序列。构建体的表达已完成大肠杆菌自动诱导培养基中的折纸DE3(Studier,2005年)在24°C下放置20小时。

PMT5-MIR结构域(残留物317-520)用不可切割的N-末端HIS6标签克隆,如对于PMT2-MIR结构域所述,表达并纯化蛋白质。

PMT-MIR结构域的纯化

请求一份详细的协议

在含有20mM Tris-HCl(pH7.0)的缓冲液中重新悬浮细胞,200mM NaCl,1mM MgCl2和20 mM咪唑,补充1x蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏)和DNase I(Sigma-Aldrich)。通过微流控器裂解细胞,清除裂解物(48000 x g,4°C,25分钟),并通过HisTrap柱(GE Healthcare)纯化蛋白质。为了释放Pmt2 MIR,将3C蛋白酶添加到与柱结合的蛋白质中。对于Pmt3 MIR,在咪唑洗脱后,添加TEV蛋白酶以去除His标记,同时保留用于Pmt2 MIR结构域的His标记,其突变体和Pmt5 MIR用于纳米DSF和MST分析。在4°C条件下进行TEV裂解,并通过在HisTrap柱上重新加载去除蛋白酶。HisTrap洗脱液被浓缩并应用于Superdex 75 26/600凝胶过滤(GE Healthcare),在20 mM Tris HCl(pH 7.0)中预平衡,Pmt2 MIR、其突变变体和Pmt5 MIR使用150 mM NaCl,Pmt3 MIR使用200 mM NaCl。将含有纯蛋白的组分汇集并浓缩至13 mg/mL(Pmt2 MIR)、15 mg/mL(Pmt3 MIR)和5 mg/mL(Pmt5 MIR)以供进一步研究。

结晶和数据收集

请求一份详细的协议

PMT2-miR的晶体在18℃下平衡的PMT2-miR的晶体,与含有85mM Hepes(pH7.5)的100μl储存器,1.7m硫酸铵,0.2M乙酸镁,5.45mM钠乙酸盐,1.7%(v / v)聚乙二醇400%和15%(v / v)甘油。从下降中直接收获晶体并陷入液氮中。衍射数据在欧洲同步辐射设备(ESRF)上以100K在BeamLine ID30B上记录。所有数据集都与XDS集成(Kabsch 2010)和AIMLESS缩放(埃文斯和Murshudov,2013).

根据含有0.1M MES(pH6.0)的储层生长PMT3-MIR的晶体,0.26M乙酸钙和15%(w / v)聚乙二醇8000.在补充有20的储层中快速浸泡晶体。通过释放到液氮中,立即立即(v / v)甘油。衍射数据在ESRF上以100K记录在光束线ID23-1的ESRF上,并为PMT2-MIR处理数据。

x射线结构解决方案、细化和验证

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对于Pmt2-MIR,使用PHENIX套件进行分子置换(Adams等人。,2010年) 使用拟南芥基质细胞衍生因子2样蛋白(SDF2,PDB-ID代码3MAL[肖特等人,2010年])作为搜索模型。手动建筑在Coot进行(埃姆斯利和考坦,2004年),用PHENIX进行改良。使用MolProbity进行验证(陈等。,2010年).Pmt3-MIR以Pmt2-MIR模型作为搜索模型,并进行了细化和验证。在2.3 Å (Pmt2-MIR低,表格1),不用于最终改进。使用pymol(Delano Scientific)制备数字。

核磁共振测量

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核磁共振实验在温度为298 K的布鲁克光谱仪(600、700、800、900或950 MHz)上进行,该光谱仪配备了低温三共振探针。Pmt2-MIR蛋白(0.1-0.4 mM)表达于大肠杆菌,同位素标记(15.N或13.C15.N)使用M9最小介质(补充15.N-ammoniumchloride和13.c - d -葡萄糖),纯化(nta亲和和superdex 75凝胶过滤),并在20 mM HEPES缓冲液中测量pH 7.5(含150 mM NaCl, 5 mM MgCl2和10%d2o)使用3 mm NMR管。光谱仪锁定在D上2以三甲基硅基丙磺酸钠(DSS)为内标,参考核磁共振谱。对于主共振分配,收集了一组三维三共振实验,包括HNCO、HN(CA)CO、HNCA、HN(CO)CA、HNCACB、HN(CO)CACB和CC(CO)NH实验13.C15.n标记的蛋白质样品。通过遵循信号(以确定一系列1D中的信号(以确定酰胺化学换档扰动,CSP)监测相互作用1H和2D1H15.N-HSQC对过量的合作伙伴进行实验(葡萄糖、葡萄糖-1-磷酸、葡萄糖-6-磷酸、甲基-α-D-葡萄糖苷、甘露糖、甘露糖-1-磷酸、甘露糖-6-磷酸、甲基-β-D-甘露糖苷、YATAV、YAT(O-Man)AV、CYATAV和CYAT(O-Man)AV)。所有光谱均使用上旋版本3.2(Bruker Biospin)进行处理,并使用SPARKY版本3.114(T。D戈达德和D。G科内尔,加利福尼亚大学,旧金山)。

测定热稳定性的纳米DSF实验

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PMT2-MIR,其突变体的变体,和PMT5-MIR在25μM的终浓度和50μM在150mM NaCl的和20mM HEPES(pH 7.5)中使用。将样品加载到与普罗米修斯NT.48(NanoTemper Technologies)中进行UV毛细血管和实验。的温度梯度被设定为具有一定范围从20℃至80℃的增加的1℃/分钟。在350nm发射波长在色氨酸荧光随温度的变化进行监测来测量蛋白质解折叠。熔化温度(tm通过在350nm处检测发光波长的最大衍生物的最大衍生物来确定。

MST测量

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蛋白质在磷酸盐缓冲盐水中用0.05%(v/v)吐温-20稀释至400 nM,并根据制造商的方案用His标签RED tris NTA(纳米热处理技术)标记。对于蛋白质标记,将等体积的400 nM蛋白质样品和200 nM染料混合,并在室温下在黑暗中使标记反应持续30分钟。使用前,将蛋白质以14000 rpm转速旋转10分钟,并在冰上保持在黑暗中。

同时,通过加入等体积的标记的蛋白质,在低结合曲线管中制备肽的十六次稀释液。将约10μl的混合物转移到玻璃毛细血管中,在整体NT.115(纳米罐技术)上之前MST测量。在100%LED激励功率下进行措施,具有40和80%的红外激光功率(MST电源)。实验以三份酸盐进行。从三个独立测量中收集的平均数据点使用k配合D.-模型在MO亲和分析软件(NanoTemper Technologies)中实现。

酵母菌株、培养条件和质粒

请求一份详细的协议

酿酒酵母野生型BY4741(的MATa; his3-1; leu2-0; met15-0; ura3-0 [Brachmann等,1998年]),等基因突变株pmt2Δ (Y00385;YAL023c: kanMX4;euro围巾)和AGY15(同基因pmt2Δ;HSP150染色体由6xHA标记;以及野生型菌株SEY6210 (MATα, his3-Δ200, leu2-3-112, lys2-801, trp1-Δ901, ura3-52, suc2-Δ9 [Robinson等人,1988])和中源性突变体pmt2pmt4(除PMT2 :: LEU2,PMT4 :: TRP1 [Gentzsch和坦纳,1996年]使用。酵母菌株在标准酵母提取物蛋白胨 - 右旋糖(YPD)或补充有所需氨基酸的酵母氮基本选择性培养基(YNB)。伴随酵母转化Gietz等人,1992年.质粒pVG80 (PMT2-HA [吉尔巴赫和斯特拉,2003年]),pJC16(ER-GFP [Castells-Ballester等人。,2019年]),pYM16(詹克等人,2004年),的YEp352(希尔等人,1986年)和YEp351a(SCW4-HA;礼品形式V. MRSA)被使用。

使用Q5位点定向诱变套件(新英格兰Biolabs)产生所有PAG质粒。对于pag1(h362.一个H364.), pAG2 (H428一个H430), pAG3 (C379.), pAG7 (F516), pAG8 (K517A)和第9页(F)516一个K517a)质粒pvg80用作模板,而PAG4(H.362.一个H364.一个H428一个H430A) pAG1被使用。质粒pJS4(左361.), pJS5 (L361.V), pJS6 (L427a),pas151(y380.), pAS152 (D384.), pAS153 (N386.a)和pas154(d384.一个N386.A)如前所述,通过重组PCR定点突变产生(Lommel et al., 2011).

HSP150的基因组标记

请求一份详细的协议

HSP150在其C末端的基因组标记为HA表位的六个副本。在其上,6×HA-HPHNT1盒的PCR从质粒pym16扩增以产生Hsp150-6xHa。将得到的PCR产物转化为酿酒酵母菌株BY4741,和pmt2Δ,以及选择转化体在含有潮霉素B(0.3毫克/毫升,#10843555001,Roche)的YPD平板上。

发现测定

请求一份详细的协议

中对数相的十倍连续稀释酿酒酵母文化从10的浓度开始6.细胞/mL,在适当的YNB板上,在指定的温度下培养96小时。

流式细胞术

请求一份详细的协议

酿酒酵母从质粒pJC16中表达ER-GFP的细胞生长到中对数期,收获并在PBS缓冲液中重悬至浓度为106.细胞/毫升。轻轻超声细胞,使用BD FACSCanto II (BD Biosciences)流式细胞术对20,000个事件的GFP荧光强度进行量化。

细胞提取物、总膜和PMT底物蛋白的分离

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如前所述,从面包酵母中分离细胞提取物和总膜(Castells-Ballester等人。,2019年).Scw4-HA分离通过以下描述的方案Grbavac等人。,2017年.为了分离Hsp150-HA的中对数期酵母细胞(10 OD)600),再悬浮在50 μL的适宜培养基中。37℃孵育2小时后,收集上清液40 μL,进一步分析。

SDS-PAGE和免疫印迹

请求一份详细的协议

蛋白样品在1x sds -样品缓冲液中变性10分钟(用于检测Pmt2和ER-GFP)或在95℃变性3分钟(用于检测Hsp150),在甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶上溶解,转移到硝基纤维素膜上。印迹与抗ha的一种抗体(来自小鼠;单克隆;1:1;# mms - 101 r;科万斯),反sec61(来自rabbit;多克隆;1:2500;来自Karin Römisch的礼物),anti-GFP(来自rabbit;多克隆; 1:2500 #A6455; Thermo Fisher Scientific) or anti-G6PDH (from rabbit; polyclonal; 1:2500; #A9521; Sigma-Aldrich). Secondary antibodies horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse (from rabbit; polyclonal; 1:5000; #A9044; Sigma-Aldrich) or anti-rabbit (from goat; polyclonal; 1:5000; #A6154; Sigma-Aldrich) were used. Protein-antibody complexes were visualized by enhanced chemiluminescence (Amersham ECL Detection Reagents; GE Healthcare).

参考文献

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决定信

  1. 黛博拉·法斯
    检查编辑器;以色列魏茨曼科学研究所
  2. 大卫·罗恩
    高级编辑;英国剑桥大学

为了提高透明度,eLife会发布最实质性的修订请求以及相应的作者回复188bet体育电竞。

验收总结:

该手稿更清楚地展示了主要的结构发现、机制含义(到目前为止它们被理解的程度),以及与其他糖基转移酶家族的关系。

同行评审后的决定书:

感谢您提交的文章“MIR域在蛋白o -甘露糖基化中的功能含义”188bet体育电竞.您的文章已被三个同行评审员审核,其中一位是客户审查编辑,评估由大卫罗恩作为高级编辑监督。审稿人选择仍然是匿名的。

审稿人相互讨论了这些评论,审稿人起草了这个决定,以帮助您准备修改后的提交。

由于编辑判断您的稿件感兴趣,但如下所述,在发布之前需要进行大量变化,我们想引起我们对我们对Covid-19作出的修订政策的变化的注意(https://188bet体育电竞www.danecarr.com/articles/57162)。首先,由于许多研究人员暂时丢失了对实验室的访问,我们将在需要提交修订的手稿时尽可能多地给作者。如果您选择,我们也提供将稿件发布到BiorXiv(如果它尚未存在)以及该决定信和稿件在修订时的正式指定188bet体育电竞".请让我们知道,如果你想追求这个选择。(如果你的作品更适合medRxiv,你需要自己发布预印本,因为我们这样做的机制仍在开发中。)

概括:

该手稿描述了蛋白o -甘露糖基转移酶(Pmt) MIR结构域的结构和糖结合特性。至少提出了三个有价值和合理的见解。首先,将甘露糖修饰的多肽与MIR结构域结合,并确定其结合位点。其次,通过诱变可以区分富含丝氨酸/丝氨酸的底物的甘露糖基化需求与缺乏丝氨酸/丝氨酸丰富区域的错误折叠底物的活性需求。第三,Pmt酶与GalNAc转移酶的比较表明了机制上的共性。本文还对肌醇三磷酸受体和ryanodine受体的MIR结构域进行了结构比较。这些研究补充了最近关于酵母Pmt1/Pmt2复合体低温电镜结构的报告,该报告也提出了MIR结构域晶体结构,并注意到与糖结合蛋白的相似性,但没有进一步探索这些观察的含义。

评价员对工作或在PMT1 / PMT2冷冻电镜结构的光的前进机械的新颖性是否足以令出版物在一个普通生物学杂志混合意见。然而,作者以实验验证他们的权利要求,并且还努力将它们放置在糖基转移酶和β含有-三叶蛋白质的领域内的更广泛的背景中理解。因此,决定邀请作者提出一个更简洁,大幅修改手稿重新评估的版本,考虑到评审的一般和具体意见。

基本修订:

要注意的建议进行缩短评审#1提供的重组。

评论家# 1:

该手稿非常恰当地选取了Bai等人2019年留下的酵母Pmt1-Pmt2甘露糖基转移酶复合物的低温- em结构。年底白等人写他们的论文,“基于此结构同源性和米尔的域位于Dol-P-Man入口上方或产品发布路径,我们认为它可能在识别中发挥作用的甘露糖基供体基质。然而,还需要更多的研究来确定这个区域的功能。”Chiapparino和他的同事现在在这类研究中取得了重大进展。

Chiapparino等人的研究结果包括:MIR结构域的晶体结构,配体结合位点的建议,与其他er定位蛋白的MIR结构域的比较,与其他碳水化合物结合的三叶折叠结构的比较,碳水化合物和肽结合的实验分析,以及体内Pmt1-Pmt2 MIR结构域功能的突变分析。

虽然总体结果是有价值的报告,书稿应大幅改组和表示应该更加集中。作者的目标应该缩短到目前长度约2/3。作者而不是强调“综合结构生物学”方法,应该专注于哪些实验和分析真正有价值,并且致力于尽可能有效(并且简洁)将时间呈现出来。这个评论者认为这个故事只是在“分析PMT2-MIR域作为CBM的分析”的故事并想知道为什么这么多的文字(小节“PMT-MIR域结构”,“PMT2-MIR域包含三个推定的配体结合位点“和”PMT2-MIR结构域在MIR系列内具有独特的特征“)被浪费才能得到基本上已知的东西 - β-三氟实折叠被识别碳水化合物结合蛋白并具有识别的结合位点。作者应在已经在其他三氟甲酸CBMS中的已知的情况下尽可能简单地将其结构研究总结如此,然后专注于自己的结合和功能实验。为了澄清,命令应该是:

1) MIR结构域为β-三叶草结构域,CBMs的一个子集为β-三叶草结构域,Pmt-MIR结构域与CBMs结构域一致;

2)NMR和MST测量;

3)与全长PMT1-PMT2复合物的结构和机制的背景下与Galnts和分析的比较和分析。

顺便说一句,在不同的环境中提供相关功能的领域的发现,给我们对自然的理解带来了统一和秩序。这一过程应伴随着统一的命名法。在阅读了I、II和III位点后,本评审者惊讶和失望地发现,在其他β-三叶草中,碳水化合物结合位点已经被称为α、β和γ。(实际上,在Boraston et al.中,α, β和γ指的是亚结构域而不是结合位点:“SlCBM13的三个β-三叶草子域被标记为α、β和γ……”)如果作者要根据已知的关于β-三叶草CBMs的知识来讨论他们的结构工作,他们可以从一开始就使用传统的命名法(不管它实际上是什么)。例如,他们可以使用α、β和γ标记,然后引入一个假定的δ位点(他们的位点III)。

评论家# 2:

在内质网中的一个常见的翻译后修饰是O-甘露糖基或甘露糖碳水化合物转移至分泌途径客户蛋白的丝氨酸/苏氨酸残基。在酵母中有七个蛋白质O型甘露糖(PMT1-7),同时在它们被称为POMT哺乳动物,只有两个(POMT1和2)。本变形例具有特别适用于细胞壁(或质膜或哺乳动物细胞的胞外基质)蛋白功能的影响。在酵母中,它也被证明是用于信号的蛋白质降解(UPOM;未折叠蛋白O-甘露糖基化)。李实验室最近解决的PMT1 / PMT2异二聚体冷冻电镜结构。这个有趣的结构主要论点集中在跨膜结构域,以及它们如何装配和定向的活性位点结合的多萜醇磷酸甘露糖活化基底。在此重要的研究中,他们也解决了管腔可溶性MIR域的结构跨膜结构域7和8作为这种结构域是蛋白的最显著管腔暴露部分之间发现,预期在底物识别参与(特别是对可溶性底物)虽然Bai等,研究并没有着眼于这方面。在光电倍增管的MIR域的作用是把重点放在当前的手稿。这里,Chaipparino等,解决了从PMT2和PMT3的MIR结构域的X射线晶体结构。 Analysis of these β-trefoil structures and their comparison to similar known structures suggest that these MIR domains might be involved in carbohydrate binding (mannosylated peptide or dolichol-P-mannose). NMR and microscale thermophoresis analysis are supportive for a role in binding mannose modified peptides (product binding) but not the dolichol-P-mannose substrate, unmodified acceptor peptides or unfolded substrates (substrate recognition for UPOM).

整体而方法是合适的和实验结果是高质量的(MIR结构在1.6埃分辨率)。总之,我不相信显著发现的洞察力推进PMT O型甘露糖基化的机制足以感兴趣的广大读者188bet体育电竞

如果MIR结构域不涉及初始衬底识别/方向,则如何溶解基材是甘膜化的识别的?

比较UPOM PMT的MIR结构域1/2)和MIR结构域(MIR结构域修饰折叠的富含Ser/Thr的蛋白(PMT4/4))。

图4A将MIR域模拟到Bai等人。,PMT的跨膜区域1/2与IP3R和RYR MIR域。这应该被打破,首先将MIR结构域仅显示在PMT跨膜区域上,然后将MIR域与PMT,IP3R和RYR进行比较。

评论家# 3:

本文描述了涉及的两个MIR域的结构研究

在ER的蛋白质中的甘露糖苷化,突变体的功能研究。虽然在我的领域之外,我发现了纸质有趣,彻底和值得出版物。

https://doi.org/10.7554/188bet体育电竞eLife.61189.sa1

作者的反应

基本修订:

要注意的建议进行缩短评审#1提供的重组。

评论家# 1:

[...]虽然整体调查结果有价值的报告,但稿件应该大大重组,并且演示文稿应该更加集中。作者的目标应该缩短到目前长度约2/3。作者而不是强调“综合结构生物学”方法,应该专注于哪些实验和分析真正有价值,并且致力于尽可能有效(并且简洁)将时间呈现出来。这个评论者认为这个故事只是在“分析PMT2-MIR域作为CBM的分析”的故事并想知道为什么这么多的文字(小节“PMT-MIR域结构”,“PMT2-MIR域包含三个推定的配体结合位点“和”PMT2-MIR结构域在MIR系列内具有独特的特征“)被浪费才能得到基本上已知的东西 - β-三氟实折叠被识别碳水化合物结合蛋白并具有识别的结合位点。作者应在已经在其他三氟甲酸CBMS中的已知的情况下尽可能简单地将其结构研究总结如此,然后专注于自己的结合和功能实验。为了澄清,命令应该是:

1) MIR结构域为β-三叶草结构域,CBMs的一个子集为β-三叶草结构域,Pmt-MIR结构域与CBMs结构域一致;

2)NMR和MST测量;

3)与全长PMT1-PMT2复合物的结构和机制的背景下与Galnts和分析的比较和分析。

我们感谢审稿人的积极评价和所有宝贵的建议,以改进我们的手稿。根据这一建议,我们已作出努力,集中重点,并大大缩短它的手稿。它现在严格按照审稿人建议的顺序执行。

在以前的版本中,我们提供了对β-三方滤折的详细描述,因为我们发现在文献中如何定义时发现了很困惑。我们想要得到这种分类。在修订版的版本中,我们大大缩短了这个部分(大约三分之一)。此外,我们显着削减了MIR域比较(不再分开章节)并将各自的图4从主文本中删除。最后,已经取出了关于PMT1的蛋白质核心的突变数据(包括补充图1)。

顺便说一句,在不同的环境中提供相关功能的领域的发现,给我们对自然的理解带来了统一和秩序。这一过程应伴随着统一的命名法。在阅读了I、II和III位点后,本评审者惊讶和失望地发现,在其他β-三叶草中,碳水化合物结合位点已经被称为α、β和γ。(实际上,在Boraston et al.中,α, β和γ指的是亚结构域而不是结合位点:“SlCBM13的三个β-三叶草子域被标记为α、β和γ……”)如果作者要根据已知的关于β-三叶草CBMs的知识来讨论他们的结构工作,他们可以从一开始就使用传统的命名法(不管它实际上是什么)。例如,他们可以使用α、β和γ标记,然后引入一个假定的δ位点(他们的位点III)。

我们为造成的混乱道歉。我们的目的不是引入新的命名法,但是我们的命名法是以一种无偏的、基于结构的方法引入的,并且后来发现(很大程度上)与CBM定义相一致(然而在文献中并不一致)。为了解决这个问题,我们现在遵循CBM命名法,并参照建议的α到δ位置。

评论家# 2:

总的来说,该方法是合适的,实验结果是高质量的(MIR结构在1.6 Å分辨率)。简而言之,我不相信发现的洞见能显著推进PMT o -甘露糖基化机制,足以引起eLife广大读者的兴趣。188bet体育电竞

我们感谢审稿人总结了我们的主要发现。然而,我们尊敬地不同意审稿人的观点,因为我们相信,我们的研究确实对我们理解MIR结构域在蛋白- o -甘露糖基化中的作用做出了重要贡献。

如果MIR结构域不涉及初始衬底识别/方向,则如何溶解基材是甘膜化的识别的?

这是非常重要的一点,但不幸的是,目前还不清楚。我们从Pmt1-Pmt2低温- em结构推断(Bai et al., 2019),尽管没有描述,识别可能发生在TMDs和MIR域之间的界面。从MIR的角度来看,保守位点δa似乎参与了底物识别,如Discussion中所述:

“最后,在所有PMT-MIR结构域内的场地ΔA(位点δ)的高保守仍然是神奇的,而是由于其在近距离接近活性位点的位置,它可能参与底肽识别。”

比较UPOM PMT的MIR结构域1/2)和MIR结构域(MIR结构域修饰折叠的富含Ser/Thr的蛋白(PMT4/4))。

这是不可能的,因为Pmt4-MIR域的结构是不可用的。Pmt4-MIR(作为POMT1)包含另外7个未知功能的残基插入(见图2)。

图4A将MIR域模拟到Bai等人。,PMT的跨膜区域1/2与IP3R和RYR MIR域。这应该被打破,首先将MIR结构域仅显示在PMT跨膜区域上,然后将MIR域与PMT,IP3R和RYR进行比较。

现在,MIR结构域的比较已经显著减少(根据评审员1的要求),并且只保留了MIR结构域重叠的面板(现在在图1-图补编2中)。

https://doi.org/10.7554/188bet体育电竞eLife.61189.sa2

文章和作者信息

作者详情

  1. 安托内拉·基帕里诺

    海德堡大学生物化学中心(BZH),德国海德堡
    贡献
    数据管理,调查,可视化,方法论,写作-原始草稿,写作-审查和编辑
    同样贡献
    Antonija Grbavac.
    相互竞争的利益
    没有竞争利益宣布
  2. Antonija Grbavac.

    德国海德堡大学有机研究中心
    贡献
    数据收藏,正式的分析,验证,调查,可视化,方法,写作 - 原草案
    同样贡献
    安托内拉·基帕里诺
    相互竞争的利益
    没有竞争利益宣布
  3. 亨德里克·RA琼克

    德国哥德大学生物分子磁共振中心有机化学与化学生物学研究所,德国法兰克福
    贡献
    数据整理、验证、调查、方法、写作-原始草案
    相互竞争的利益
    没有竞争利益宣布
    ORCID图标 “此Orcid ID标识本文的作者:”0000-0002-5582-3931
  4. yvonne hackmann.

    海德堡大学生物化学中心(BZH),德国海德堡
    贡献
    形式分析,调查,写作-初稿
    相互竞争的利益
    没有竞争利益宣布
  5. 索菲亚·莫特森

    海德堡大学生物化学中心(BZH),德国海德堡
    贡献
    数据策策,调查
    相互竞争的利益
    没有竞争利益宣布
    ORCID图标 “此Orcid ID标识本文的作者:”0000-0003-1631-6651
  6. Ewa Zatorska

    德国海德堡大学有机研究中心
    贡献
    数据策策,调查
    相互竞争的利益
    没有竞争利益宣布
  7. 安德里亚Schott

    德国海德堡大学有机研究中心
    贡献
    数据管理,验证,调查
    相互竞争的利益
    没有竞争利益宣布
  8. Gunter金牛

    海德堡大学生物化学中心(BZH),德国海德堡
    贡献
    数据管理,调查,方法论
    相互竞争的利益
    没有竞争利益宣布
  9. 克里希纳Saxena

    德国哥德大学生物分子磁共振中心有机化学与化学生物学研究所,德国法兰克福
    贡献
    数据整理、验证、调查、方法、写作-原始草案
    相互竞争的利益
    没有竞争利益宣布
  10. 克莱曼野生

    海德堡大学生物化学中心(BZH),德国海德堡
    贡献
    监督,验证,调查,可视化,方法,写作 - 原始草案,写作 - 审查和编辑
    相互竞争的利益
    没有竞争利益宣布
    ORCID图标 “此Orcid ID标识本文的作者:”0000-0001-9733-8187
  11. Harald Schwalbe.

    德国哥德大学生物分子磁共振中心有机化学与化学生物学研究所,德国法兰克福
    贡献
    概念化,监督,资金获取,验证,方法,写作-原始草案,项目管理
    相互竞争的利益
    没有竞争利益宣布
    ORCID图标 “此Orcid ID标识本文的作者:”0000-0001-5693-7909
  12. Sabine特拉

    德国海德堡大学有机研究中心
    贡献
    概念化,监督,资助收购,验证,方法,写作 - 原始草案,项目管理,写作 - 审查和编辑
    为对应
    sabine.strahl@cos.uni-heidelberg.de
    相互竞争的利益
    没有竞争利益宣布
    ORCID图标 “此Orcid ID标识本文的作者:”0000-0002-4024-0741
  13. Irmgard犯罪

    海德堡大学生物化学中心(BZH),德国海德堡
    贡献
    概念化,资源,监督,资金获取,验证,方法,写作-初稿,项目管理,写作-审查和编辑
    为对应
    irmi.sinning@bzh.uni-heidelberg.de
    相互竞争的利益
    没有竞争利益宣布
    ORCID图标 “此Orcid ID标识本文的作者:”0000-0001-9127-4477

资金

德国研究基金会(2509 SI586 / 8-1)

  • Irmgard犯罪

德国科学基金会(201348542-SFB1036 TP11)

  • Sabine特拉

德国研究基础(2509 str443 / 5-1)

  • Sabine特拉

德国研究基金会(FOR2509 SCHW701/20-1)

  • Harald Schwalbe.

德国研究基金会(莱布尼茨计划SI586/6-1)

  • Irmgard犯罪

德国研究基金会(201348542-SFB1036 TP22)

  • Irmgard犯罪

资助方没有参与研究设计、数据收集和解释,也没有决定是否将研究提交出版。

致谢

我们感谢Vladimir Mrša提供的质粒YEp351a,感谢Karin Römisch提供的Sec61直接抗体。我们非常感谢Karine Lapouge的卓越科学支持,Anke Metschies和Elke Herwig的卓越技术支持,Jessika Sonnabend的Pmt2亮氨酸突变体的初始克隆和特性,Zuzanna Koskova的MST测量帮助,Daniela Bausewein在整个项目中进行了许多有益的讨论,以及梅勒妮·麦克道尔对手稿的仔细校对。我们感谢流式细胞术和FACS核心设施(ZMBH,海德堡大学;德国)获得卓越的技术支持。我们感谢来自BZH/Cluster of Excellence: CellNetworks结晶平台的Jürgen Kopp和Claudia Siegmann,并感谢格勒诺布尔欧洲同步加速器辐射设施(ESRF)的光束以及光束科学家的支持。我们感谢科学、研究和艺术部Baden-Württemberg (MWK)和德国研究基金会(DFG)通过拨款INST 35/1314-1和INST 35/1503-1 FUGG支持的数据存储服务SDS@hd。IS是卓越集群:蜂窝网络的研究员。本研究由德国研究基金会(DFG)资助,项目编号:201348542-SFB1036 (TP11到SS, TP22到IS), Forschungsgruppe FOR2509 (SCHW701/20-1到HS;SI586/8-1是; STR 443/5–1 to SS), and the Leibniz program (SI 586/6–1) to I.S. Work at BMRZ is supported by the state of Hessen.

高级编辑

  1. David Ron,英国剑桥大学

审核编辑

  1. Deborah Fass,Weizmann科学研究所,以色列

出版的历史

  1. 收稿日期:2020年7月17日
  2. 接受:2020年12月8日
  3. 出版版本:2020年12月24日(第1版)

版权

©2020,Chiapparino等。

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韵律学

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    Lakshmi E Miller-Vedam等。
    研究文章 更新

    内质网(ER)中的膜蛋白生物发生是复杂的并且易于损失。包含八个保守亚基的ER膜蛋白复合物(EMC)已成为该过程中的中心播放器。然而,我们对EMC如何能够插入和完整的不同客户,从尾翼锚定到多粒跨膜蛋白。这里,酵母和人体EMC Cryo-EM结构揭示了与病理相关的保守复杂的组件和人的特异性。基于结构的功能研究区分了两种可分离的EMC活性,作为调节尾锚蛋白水平的渗透酶和更广泛的角色在多种子质膜蛋白生物发生中。这些取决于机械耦合的又空间不同的区域,包括赋予客户特异性调节的两个脂质可接近的膜腔,以及由EMC流明结构域介导的非延期酶EMC功能。我们的研究阐明了EMC多功能性的结构和机械基础,并指出了其在差异调节不同客户蛋白类别的生物发生方面的作用。